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一項15年的回顧性研究揭示了可溶性ST2、高敏感性心肌肌鈣蛋白和NT-proBNP這三種生物標誌物在2型糖尿病患者中對心血管疾病風險的預測價值。研究表明，這些標誌物與心血管事件的發生和患者的15年死亡率密切相關，為臨床實踐中的風險評估和管理提供了新的參考指標。

突破性研究發現：新生物標誌物對2型糖尿病心血管風險有重大預測價值

Prognostic value of soluble ST2, high-sensitivity cardiac troponin, and NT-proBNP in type 2 diabetes: a 15-year retrospective study

Jacopo Sabbatinelli, Angelica Giuliani, Anna Rita Bonfigli, Deborah Ramini, Giulia Matacchione, Carla Campolucci, Artan Ceka, Elena Tortato, Maria Rita Rippo, Antonio Domenico Procopio, Marco Moretti & Fabiola Olivieri
Cardiovascular Diabetology volume 21, Article number: 180 (2022) Cite this article

https://cardiab.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12933-022-01616-3

摘要

背景

2型糖尿病(T2DM)患者呈現增加的心血管（CV）疾病風險和過度的心血管相關死亡率。除了腦利尿肽(BNP)和心肌肌鈣蛋白(cTn)的確定作用外，其他非心臟特異性生物標誌物正在成為T2DM中心血管結果的預測指標。

方法

在568名T2DM患者和115名健康對照（CTR）中評估可溶性抑癌基因2 (sST2)、高敏感性(hs)-cTnI和N-末端(NT)-proBNP的血清水平。使用Cox模型和邏輯回歸，在中位數16.8年的隨訪期間測試了T2DM患者的全因死亡率與糖尿病併發症發展的關聯。

結果

sST2從CTR顯示出上升的趨勢，到未併發症的T2DM患者(T2DM-NC)，再到至少有一個併發症的患者(T2DM-C)；而hs-cTnI在T2DM-C中顯著高於CTR，但與T2DM-NC相比則沒有差異。發現sST2（HR 2.76 [95% CI 1.20-6.33]對於≥32.0 ng/mL和2.00 [1.02-3.94]對於16.5-32.0 ng/mL比較<16.5 ng/mL，C-statistic=0.729）、NT-proBNP（HR 2.04 [1.90-4.55]對於≥337 ng/L和1.48 [1.05-2.10]對於89-337 ng/L比較<89 ng/L，C-statistic=0.741）與T2DM中的15年死亡率呈分級關聯，而hs-cTnI≥7.8 ng/L的患者觀察到死亡率增加（HR 1.63 [1.01-2.62]）。基於sST2、hs-cTnI和NT-proBNP的組合的‘心臟評分’與全因死亡率（HR 1.35 [1.19-1.53]，C-statistic=0.739）和心血管事件的發展顯著相關。

結論

sST2、hs-cTnI和NT-proBNP與T2DM中的15年死亡率和心血管事件的發病率相關。sST2的長期預後價值及其追踪與胰島素抗性及相關代謝疾病相關的變數的能力支持其在常規臨床實踐中的實施。

Abstract

Background

Patients with type 2 diabetes (T2DM) present an increased risk of cardiovascular (CV) disease and excess CV-related mortality. Beyond the established role of brain natriuretic peptide (BNP) and cardiac troponins (cTn), other non-cardiac-specific biomarkers are emerging as predictors of CV outcomes in T2DM.

Methods

Serum levels of soluble suppression of tumorigenesis 2 (sST2), high-sensitivity (hs)-cTnI, and N-terminal (NT)-proBNP were assessed in 568 patients with T2DM and 115 healthy controls (CTR). Their association with all-cause mortality and the development of diabetic complications was tested in T2DM patients over a median follow-up of 16.8 years using Cox models and logistic regressions.

Results

sST2 followed an increasing trend from CTR to uncomplicated T2DM patients (T2DM-NC) to patients with at least one complication (T2DM-C), while hs-cTnI was significantly higher in T2DM-C compared to CTR but not to T2DM-NC. A graded association was found between sST2 (HR 2.76 [95% CI 1.20–6.33] for ≥ 32.0 ng/mL and 2.00 [1.02–3.94] for 16.5–32.0 ng/mL compared to < 16.5 ng/mL, C-statistic = 0.729), NT-proBNP (HR 2.04 [1.90–4.55] for ≥ 337 ng/L and 1.48 [1.05–2.10] for 89–337 ng/L compared to < 89 ng/L, C-statistic = 0.741), and 15-year mortality in T2DM, whereas increased mortality was observed in patients with hs-cTnI ≥ 7.8 ng/L (HR 1.63 [1.01–2.62]). A ‘cardiac score’ based on the combination of sST2, hs-cTnI, and NT-proBNP was significantly associated with all-cause mortality (HR 1.35 [1.19–1.53], C-statistic = 0.739) and development of CV events.

Conclusions

sST2, hs-cTnI, and NT-proBNP are associated with 15-year mortality and onset of CV events in T2DM. The long-term prognostic value of sST2 and its ability to track variables related to insulin resistance and associated metabolic disorders support its implementation into routine clinical practice.

背景

當前的流行病學數據已經證明，與非糖尿病患者相比，2型糖尿病(T2DM)的心血管(CV)併發症的整體風險增加了2-4倍，即使在調整傳統風險因素後也是如此[1]。用於糖尿病患者的風險模型通常不包括除膽固醇、糖化血紅蛋白(HbA1c)和尿液白蛋白-肌酸酐比值(UACR)以外的生物標誌物信息，這引發了一個問題，即在T2DM患者中添加新的生物標誌物是否會改善CV風險預測[2]。

大量的證據已經發表，關於單一生物標誌物與T2DM中的CV風險的相關性，但在糖尿病人群中對大量生物標誌物的同時評估卻很有限[3,4,5]。更近期，人們主張在T2DM的CV結果試驗中使用心臟生物標誌物[6, 7]。儘管已經證明對其進行評估無疑會提高對發展終點如主要不良CV事件(MACE)風險的區分和重新分類[8, 9]，但對於它們的連續測量是否可能有助於預測CV死亡率或T2DM藥物的心臟保護效益仍存在不確定性[10,11,12]。雖然心臟特異性生物標誌物腦利尿肽(BNP)和心肌肌鈣蛋白(cTn)已經確立為心力衰竭(HF)和心肌損傷的診斷的基石[13]，但越來越多的證據支持了多種非心臟特異性生物標誌物在描述HF最相關的病理生理特徵中的作用，即炎症、氧化應激、細胞外基質重塑、神經內分泌活化、心肌細胞損傷和壓力[14, 15]。其中，可溶性抑制腫瘤生成-2 (sST2)，一種白介素1受體家族的成員，被證明是慢性HF患者的一個有效的預後生物標誌物[16]。sST2主要在應對促炎和促纖維化刺激的非心臟組織中產生[17]。通過作為循環中白介素-33 (IL-33)的分子陷阱，它阻止了ST2/IL-33信號的心臟保護作用，從而促進了不適應性心肌肥厚和心肌細胞凋亡[18]。雖然已有多項觀察性研究研究了T2DM中的sST2水平[19, 20]，但其預後作用的數據僅限於短期隨訪，且對其在已確立的心臟生物標誌物—BNP和cTn—之上的增值還未進行廣泛評估。

本研究的主要目的是研究高敏感性(hs)-cTnI、N-末端(NT)-proBNP和sST2單獨或組合對於T2DM患者全因死亡率和糖尿病併發症的發展（包括MACE）的相關性。此外，我們還旨在比較T2DM患者和健康對照受試者之間這些生物標誌物的水平，並評估它們與評估血糖控制、器官損傷和T2DM臨床特徵的變量的相關性。

材料和方法

研究人群

樣本來自之前發表的一個由568名T2DM患者和618名健康對照組成的隊列[21]。患者和對照組在2003年5月至2006年11月期間在IRCCS INRCA的代謝疾病和糖尿病學部門招募。所有T2DM患者（中位數年齡=67歲，IQR 61-72歲）和115名隨機選取的年齡和性別匹配的健康對照受試者(CTR)（中位數年齡=68歲，IQR 62-73歲）被納入本次調查。根據ADA標準診斷T2DM，即患有HbA1C≥6.5%或空腹血糖≥126 mg/dl或OGTT後2小時血糖濃度≥200 mg/dl或在出現嚴重糖尿病症狀時隨機血糖≥200 mg/dl的患者[22]。糖尿病患者的納入標準為BMI<40 kg/m2，年齡40-87歲，能夠且願意給予書面知情同意。

對照組中的受試者進行了一次醫學評估，包括完整的病史和臨床檢查。有冠狀動脈疾病、中風和周邊血管疾病的臨床史的受試者被排除在研究之外。高血壓定義為收縮壓> 140 mm Hg和/或舒張壓> 90 mm Hg。有糖尿病病史或者經確認重複檢測後空腹血糖≥126 mg/dL的受試者被認為是糖尿病患者並被排除。所有受試者的空腹血樣本被加工以獲得血清並存儲在-80°C。

該研究已經得到IRCCS INRCA醫院的機構評審委員會批准（批准編號：34/CdB/03）。根據赫爾辛基宣言的原則，從每位參與者處獲得了書面知情同意。

生物標記

在分析之前，所有血清樣本都進行了溶血檢查。sST2血清水平使用Atellica® CH 930分析儀（Siemens Healthineers, 德國）通過Sequent-IA™ ST2 Assay (Critical Diagnostics, 美國)進行評估，目前在歐洲已獲得CE-IVD標記，且預計提交給美國FDA審查。該測試使用了在FDA批准的Presage® ST2 Assay（Critical Diagnostics）中使用的相同的單克隆抗體對。其線性範圍是15-300 ng/mL，當sST2濃度為26 ng/mL時，其內部和外部測試的CV分別是6.5%和8.6%。在sST2濃度為75 ng/mL時，CV值分別為2.8%和3.8%。血清hs-cTnI和NT-proBNP使用Dimension Vista® 1500自動化生化分析儀上，基於LOCI®技術的Dimension Vista®高敏感度肌鈣蛋白I (TNIH) 和 NT-proBNP (PBNP) 測試進行評估（Siemens Healthineers, 德國）。對於TNIH測試，空白限度(LoB)、檢測限度(LoD) 和定量限度(LoQ) 分別為1.0 ng/L、2.0 ng/L 和3.0 ng/L。廠商報告的線性範圍為3.0-25,000.0 ng/L。為血清確定的99分位數分別為女性的51.1 ng/L 和男性的74.9 ng/L。對於PBNP測試，LoB、LoD 和LoQ 分別為0.2 ng/L、0.8 ng/L 和5.0 ng/L。廠商報告的線性範圍為5.0-35,000.0 ng/L。為了比較hs-cTnI方法，一部分血清樣本使用Architect i1000SR免疫分析儀上的ARCHITECT STAT高敏感性肌鈣蛋白I測試進行評估（Abbott Diagnostics, 伊利諾伊州, 美國）。LoB、LoD 和LoQ 分別為0.7-1.3 ng/L、1.1-1.9 ng/L 和1.5-2.9 ng/L。廠商報告的線性範圍為3.0-25,000.0 ng/L。為鋰肝素血漿確定的99分位數分別為女性的53.7 ng/L 和男性的78.5 ng/L。廠商建議的以下截止點用於對無症狀個體的心血管疾病風險進行分層：男性，低，<6 ng/mL，中等，6-12 ng/mL，高>12 ng/mL；女性，低，<4 ng/mL，中等，4-10 ng/mL，高>10 ng/mL。

結果

結果事件是以新發生的MACE（在入組時無MACE病史的患者中）、T2DM併發症（在入組時無T2DM併發症病史的患者中）和全因死亡率來衡量。MACE被定義為心肌梗死、心臟驟停、心源性休克、致命性心律失常或中風的非致命性發生。此外，還評估了MACE和全因死亡率的綜合終點。從入組日期（2003年5月至2006年11月）到最後的隨訪日（2019年12月31日）從醫療記錄中收集了關於結果的隨訪信息。具體來說，收集了有關BMI、血糖控制（HbA1c）、腎功能（eGFR，尿液白蛋白至肌酐比值）以及T2DM併發症的發展情況，包括MACE的隨訪信息。

共變數

所有參與者的生命徵象、人體測量數據、病史、行為、運動和共同治療信息均被收集。所有受試者的血細胞計數和生化變量均按照標準程序進行評估。根據血清肌酸酐、年齡、性別和種族，根據CKD-EPI（慢性腎臟病流行病學合作組織）方程計算估計的腎小球過濾率（eGFR）。已經如前述的方式確定了糖尿病併發症的存在[23]。糖尿病視網膜病變通過瞳孔擴張的眼底檢查和/或螢光血管造影進行評估；早期腎病被定義為尿蛋白排泄率> 30 mg/24 h和正常肌酐清除率；通過肌電圖確定了神經病變；以臨床病史和/或缺血性心電圖改變定義缺血性心臟病；根據病史、體檢和多普勒速度測量確定了周邊動脈疾病，包括動脈粥樣硬化和腦血管疾病。在基線，103名患者患有神經病變，53名患者患有動脈粥樣硬化性血管疾病，84名患者患有主要不良心血管事件（MACE），74名患者患有腎病變，156名患者患有視網膜病變。

統計分析

連續變量根據其分布（使用Shapiro-Wilk檢驗進行評估）報告為平均值和標準差或中位數和四分位數。在分析中，生物標記濃度低於LoQ的值被替換為LoQ除以2的平方根。使用Mann-Whitney U檢驗和Kruskal-Wallis檢驗後跟Dunn事後檢驗來比較不同組別之間的血清心臟生物標記。使用χ2檢驗來比較分類變量。使用Spearman的相關性分析來評估連續變量之間的相關性。使用二元變異數分析（ANCOVA）來探討不同組別之間血清心臟生物標記的性別相關差異。使用多變量ANCOVA，以sST2，NT-proBNP和hs-cTnI的對數轉換濃度為依變量，T2DM併發症為因子，年齡，性別和HbA1c為共變量來建構與T2DM併發症和治療相關因素。報告單變量後hoc比較的結果。箭頭表示依變量在併發症/治療下的顯著增加。使用Kaplan-Meier曲線和Cox比例風險分析（根據性別，年齡，吸煙狀況，高血壓，T2DM持續時間，BMI，HbA1c，血脂，eGFR和hs-CRP進行調整）探討心臟生物標記（sST2，NT-proBNP和Dimension Vista hs-cTnI）濃度與隨訪結果之間的關聯（包括95％置信區間）。使用羅吉斯回歸來評估涵蓋MACE的結果的相關性，因為大多數事件無法精確地定性。

使用Evaluate Cutpoints R軟件包[24]計算了預測T2DM患者存活的最佳sST2、hs-cTnI和NT-proBNP切點。生物標記被拟合為連續或分類變量。根據計算的切點，每個生物標記被分為低、中和高三個等級。對於每個變量的水平分配了1-3分（1=低、2=中、3=高，根據先前定義的切點），並將每個生物標記的分數相加，得到一個名為“心臟得分”的結果，範圍從3到9。通過使用替代的Abbott Architect i-STAT高敏感Troponin I試劑盒對238個T2DM樣本的子集進行敏感性分析。Cox比例風險分析如上所述進行，僅包括使用Architect hs-cTnI方法測試的樣本。使用Bland-Altman圖和Passing-Bablok回歸比較了兩種方法的結果。僅對於方法比較，將Architect hs-cTnI濃度低於Dimension Vista hs-cTnI LoQ的值替換為Dimension Vista LoQ除以2的平方根。根據多變量Cox回歸分析的結果，使用“hdnom”軟件包（版本6.0.0）建立了預測T2DM的5年、10年和15年存活率的名為“心臟得分”的結果。具體來說，使用十折交叉驗證的自適應LASSO程序在整個樣本上進行了懲罰Cox回歸模型的訓練。名為“心臟得分”的結果在100個bootstrap樣本和包含原始樣本三分之一的驗證集上進行了評估。使用內部和外部校準和判別統計量來評估預測效能。使用連續淨重新分類改進（NRI>0）[26]來評估重新分類。接受p<0.05作為顯著性水平。所有數據均使用R（版本4.1）、Jamovi軟件（版本2.3.1）和SPSS 26.0 for Windows軟件（SPSS Inc.，芝加哥，IL，美國）進行分析。

結果

研究共分析了683名受試者的血清樣本，包括568名2型糖尿病（T2DM）患者和115名年齡和性別匹配的據信是健康對照組（CTR）。基線受試者特徵如表1所示。兩組受試者在與人體測量數據、脂質水平和血糖控制相關的多個變量上有顯著差異。在中位隨訪16.8（IQR，13.1–16.8）年後，有202名患者死亡（35.6％），並有7名患者（1.2％）失訪。平均存活時間為14.3（95％CI 13.9–14.7）年。在入組時，309名患者（54.4％）至少有一種併發症。在入組時，有259名患者（45.6％）未併發T2DM，其中159名患者（61.4％）發展至少一種併發症。與至少有一種併發症的患者相比，未併發T2DM的患者存活率較高（對數秩檢驗，p <0.001; 附加文件1：圖S1）。

表1 健康對照組（CTR）與2型糖尿病患者（T2DM）之間生化和人體測量特徵的比較

對健康對照組和2型糖尿病患者進行基線sST2、hs-cTnI和NT-proBNP的分析

與CTR相比，T2DM患者的血清sST2中位數（21.8 vs 19.1 ng/mL，p <0.0001）和hs-cTnI（6.1 vs 5.7 ng/L，p = 0.0077）水平較高，而NT-proBNP（62 vs. 69 ng/L，p = 0.453）沒有顯著差異（圖1A）。如預期的那樣，濃度的分佈呈現明顯的右偏（偏度係數，sST2 = 5.33，hs-cTnI = 9.38，NT-proBNP = 5.64；附加文件1：圖S2）。因此，為進行後續分析，對這三個變數進行了對數轉換。原始和轉換後的濃度見附加文件1：表S1。

圖1

當T2DM患者根據併發症的存在進行分類時，ln（sST2）呈現增加的趨勢，T2DM併發症組（T2DM-C）的值最高（p <0.001）。觀察到ln（cTnI）值在T2DM併發症患者中顯著增加，與T2DM無併發症患者（T2DM-NC）（p <0.001）和CTR（p = 0.026）相比，而T2DM-NC和CTR之間沒有顯著差異（p = 0.466）。關於NT-proBNP，其水平在CTR與T2DM-NC（p = 0.040）中較高，在T2DM-C與T2DM-NC（p <0.001）之間也較高。顯示了各組之間的每個生物標記物水平，如圖1B所示。在探索性別特異性差異時，我們觀察到男性T2DM中的ln（sST2）較高（雙向ANOVA，p <0.001）。另一方面，ln（NT-proBNP）在女性中顯著較高（p = 0.008），而ln（cTnI）的性別相關差異沒有顯著差異（p = 0.071）（如圖1C所示）。

我們進一步探討了三種心臟生物標記物（以ln表示）與可用生化變量之間的相關性。正如預期的那樣，三種生物標記物之間呈現顯著的相互相關性，其中hs-cTnI和NT-proBNP具有最高的相關係數（Spearman’s rho = 0.47，p <0.001）。圖2中的相關圖彙總了CTR和T2DM組中每對變量的Spearman’s相關係數。完整的相關矩陣可在附加文件1：表S2中找到。值得注意的是，hs-cTnI和NT-proBNP，但不是sST2，與年齡呈現顯著正相關。這些與年齡的相關在CTR受試者中特別明顯（hs-cTnI，ρ = 0.29，p = 0.001; NT-proBNP，ρ = 0.59，p <0.001），而在T2DM患者中觀察到較弱的相關（hs-cTnI，ρ = 0.26，p <0.001; NT-proBNP，ρ = 0.49，p <0.001）。只有hs-cTnI和NT-proBNP與疾病持續時間呈現顯著正相關。值得注意的是，在T2DM中，sST2是唯一一個與與血糖控制相關的變量（包括空腹血糖，HbA1c和HOMA指數）以及肝功能測試呈現顯著正相關的生物標記物。此外，在T2DM中觀察到sST2和hs-cTnI與腰臀比呈現正相關。hs-cTnI和NT-proBNP水平隨著腎功能惡化而增加，而hs-cTnI和在較小程度上NT-proBNP則與脂質譜有明確的相關性，與LDL-C和總膽固醇呈現負相關。關於系統性的炎症狀態，三種生物標記物與hs-CRP和中性粒細胞%呈正相關，與淋巴細胞%呈負相關。NT-proBNP與IL-6和纖維蛋白原呈正相關。值得注意的是，sST2和NT-proBNP與GDF-15的血漿濃度呈正相關，GDF-15是心衰竭的一種創新生物標記物[27]，我們之前在一個患者亞組中對其進行了評估[28]。

圖2

為探討T2DM併發症和治療對sST2、hs-cTnI和NT-proBNP水平的影響，我們在校正了年齡、性別和HbA1c後進行了多元MANCOVA測試，然後進行了單因素ANOVA測試和Tukey事後檢驗（參見附加文件1：表S3）。 NT-proBNP水平在有併發症的患者中較高，hs-cTnI在除了腎病外的所有T2DM併發症中較高。值得注意的是，複雜的T2DM患者的sST2水平較高，而其存在的特定併發症不影響sST2水平。關於T2DM治療，我們觀察到接受胰島素治療的患者三個生物標記的水平較高。

sST2、hs-cTnI和NT-proBNP在2型糖尿病中的預測價值

隨後，我們旨在評估sST2、hs-cTnI和NT-proBNP單獨或聯合是否能夠預測T2DM患者的15年存活率，以及它們是否在包括性別、年齡、吸煙狀況、高血壓、T2DM持續時間、BMI、HbA1c、血脂、eGFR和hs-CRP等最相關的臨床和生化預測因子的參考模型中有顯著增益，使用Kaplan-Maier方法和單變量和多變量Cox回歸方法。首先，將sST2、hs-cTnI和NT-proBNP分為3組（即低、中、高）。計算用於T2DM患者的截止值，以最大化組間存活預測之間的差異，如下：sST2; 低，<16.5 ng/mL; 高，≥32.0 ng/mL; hs-cTnI; 低，<4.2 ng/L; 高，≥7.8 ng/L; NT-proBNP; 低，<89 ng/L; 高，≥337 ng/L。

在單變量分析中，所有心臟生物標記與T2DM的全因死亡率均顯示出顯著相關性（表2）。校正混淆因素的多變量Cox回歸分析顯示，sST2與T2DM患者的死亡率存在顯著相關（模型C統計量=0.729，95％CI 0.696–0.762）。具體來說，高sST2水平的患者與低血清水平的患者相比，死亡風險增加約三倍。同樣，高hs-cTnI水平的患者也存在增加的風險（C統計量=0.729，95％CI 0.694–0.764）。對於NT-proBNP（C統計量=0.741，95％CI 0.706–0.776），中等和較高水平的個體死亡風險增加約1.5倍和3倍，分別。相應的Kaplan-Meier曲線如圖3A，B，C所示。

表2：每個生物標記和結合的'心臟評分'在預測2型糖尿病患者生存方面的多重Cox回歸分析摘要 圖3

為增強三種生物標記的預測準確性，我們根據先前定義的截點，將每個標記的水平賦予分數（1 = 低，2 = 中，3 = 高），並通過將分數相加來計算綜合評分，評分範圍為3至9。組合的“心臟評分”與全因死亡風險獨立相關（C-統計量 = 0.739，95% CI：0.706–0.772），處於“中等”類別的患者死亡風險增加約兩倍，而處於“高”類別的患者死亡風險增加約3.5倍（表2）。對應的Kaplan–Meier曲線顯示於圖3D中。此外，當將“心臟評分”視為連續變量時，每增加一分與死亡風險顯著增加（HR：1.35，95%CI 1.19–1.53）。所有三種生物標記以及心臟評分均提高了參考模型的C-統計量（附加文件1：表S4）。將心臟生物標記作為分類變量添加到傳統風險因素模型的預測模型的分類自由連續NRI>0在5年、10年和15年的隨訪中分別為0.402（95%CI 0.093–0.717）、0.302（95%CI 0.105–0.493）和0.335（95%CI 0.081–0.586）。

對於沒有先前MACE病史的2型糖尿病患者，組合分數也與全因死亡或MACE的機率相關。通過二項邏輯回歸（校正性別、年齡、BMI、HbA1c、血脂、eGFR和hs-CRP），顯示分數與全因死亡或MACE的機率增加相關（每增加1分，OR：1.34，95%CI 1.11–1.62）（附加文件1：表S5）。圖4A顯示了根據分數發展結果的概率，而模型的ROC曲線（敏感性，75.8%；特異性，62.8%；AUC：0.770）顯示於圖4B中。沒有任何生物標記，也沒有它們的組合與發展每個2型糖尿病併發症的風險相關（數據未顯示）。

圖4

肌鈉蛋白I（troponin I）檢測方法之間的比較

對於額外的敏感性分析，我們對238個2型糖尿病樣本進行了Abbott Architect i-STAT高敏感肌鈉蛋白I檢測，該檢測已獲得CE標準認證，用於預測無心臟疾病臨床症狀的MACE。hs-cTnI濃度的分佈顯示在附加文件1：圖S3A中。hs-cTnI濃度範圍為1.1至67.6 ng/L。平均hs-cTnI濃度為8.8 ng/L，中位數濃度為5.8 ng/L（四分位範圍3.9–9.2 ng/L）。通過Passing-Bablok回歸對兩種hs-cTnI檢測進行比較，發現有較好的相關性（y = 0.13 + 0.94x，95％CI斜率0.83–1.07，95％CI截距-0.47–0.55）；附加文件1：圖S3B。Bland-Altman分析顯示偏差均值為3.7 ng/L（95％CI 1.3–6.2 ng/mL），有利於Dimension Vista檢測。偏差百分比為7.7％。下限一致性（LLA）為-34.0 ng/L，上限一致性（ULA）為41.4 ng/L（附加文件1：圖S3C）。在過濾掉平均值超過40 ng/L的樣本後（結果n = 224），觀察到0.2 ng/L的無顯著偏差（95％CI -0.8–1.1）。偏差百分比為2.4％，LLA和ULA分別為-13.7 ng/L和14.0 ng/L（附加文件1：圖S3D）。

同樣地，我們也測試了Abbott Architect i-STAT高敏感肌鈉蛋白I檢測的預測T2DM患者存活的能力。首先，基於最佳預測性能，計算了兩個截點，即4.4 ng/L和7.5 ng/L。因此，hs-cTnI，以分類變量（低、中、高）重新編碼，被適應到了校正後的Cox回歸模型中，該模型僅在使用Abbott方法進行評估的樣本中計算。與Dimension Vista hs-cTnI檢測類似，相較於低水平（<4.4 ng/L）的患者，高hs-cTnI-AB水平（≥7.5 ng/L）的患者觀察到死亡風險增加（HR: 2.97，95％CI 1.52–5.79），而中間水平的患者則未觀察到死亡風險的增加（附加文件1：表S6）。有趣的是，即使按照制造商提供的性別特定風險類別對T2DM患者進行分層，也確認了高風險類別中患者的死亡風險顯著增加（HR: 2.10，95％CI 1.11–4.00）。

預測的範疇圖

基於Cox迴歸模型的結果，我們使用自適應LASSO迴歸模型和多變量Cox迴歸分析來預測基於以下變數的2型糖尿病在5年、10年和15年的存活率：年齡、性別、HbA1c、eGFR、血脂、hs-CRP以及心臟生化指標sST2、Dimension Vista hs-cTnI和NT-proBNP作為分類變量。為此目的，樣本隨機分成訓練（n = 375）和驗證（n = 186）數據集，死亡個體的比例大致相等。LASSO過程中排除了性別、eGFR和血脂。圖5A以範疇圖的形式呈現該模型，該範疇圖提供了與特定總分相對應的長期存活概率。患者的總分是通過將七個預測因子的分數加起來得到的。在訓練數據集上執行的內部驗證使用bootstrap重抽樣顯示，全因死亡預測的範疇圖的AUC分別在5年、10年和15年為0.685、0.770和0.758（附加文件1：圖S4A），而驗證數據集的AUC分別在5年、10年和15年為0.760、0.772和0.795（圖5B）。內部和外部校正圖顯示觀測值和預測值之間存在良好的一致性和相關性（附加文件1：圖S4B）。根據範疇圖預測的風險概況，生成了4個患者的均勻組，並構建了Kaplan-Meier存活曲線（圖5C）。log-rank檢驗確認根據範疇圖為基礎的死亡風險評分對病人進行分組的存活曲線顯著不同（p = 7.9 x 10^(-26)）。

圖5

討論

在我們的回顧性研究中，我們觀察到sST2，和在較小程度上的NT-proBNP，在健康對照（CTR）和至少有一種併發症的2型糖尿病（T2DM-C）患者之間呈現上升趨勢。另一方面，僅在T2DM-C中明顯看到使用Dimension Vista方法測定的hs-cTnI水平的增加。之前的觀察性研究顯示sST2與T2DM的關聯，儘管關於併發症方面的疾病嚴重性報導了相互矛盾的結果。Fousteris等人發現，與健康對照組相比，T2DM患者的sST2較高，但對於根據左心室舒張功能障礙的存在分組的T2DM患者，沒有觀察到差異[29]。這些結果得到了對Framingham Heart Study Offspring隊列的3’450參與者的sST2血清的更廣泛評估的確認[30]。值得注意的是，sST2是唯一與T2DM中的血糖控制明確相關的生物標記，特別是與空腹血糖、HbA1c和HOMA指數的直接相關，這與先前對T2DM[20]和健康[31]個體的較小隊列的報導一致。此外，在T2DM患者中，觀察到sST2與肝功能標記，如AST、ALT、gamma-GT和ALP之間的正相關模式。在肝病中，如在肝纖維化和B型肝炎[32]中觀察到的，受壓迫的肝細胞釋放IL-33，這已被證明可以通過同時抑制促凋亡基因的表達和啟動抗凋亡基因來保護肝細胞[33]。

因此，可以想像，在T2DM患者中，sST2的高水平可能會削弱此途徑，從而加速與胰島素抗性相關的肝損傷的積累。

關於腎功能，我們觀察到隨著eGFR的下降，hs-cTnI和NT-proBNP的水平增加，並在糖尿病性腎病中觀察到後者的水平較高，這與多份先前的報導相一致[34,35,36]。儘管NT-proBNP隨著腎功能惡化而積累構成了此生物標記的固有限制，但研究顯示，只要NT-proBNP水平在下降，治療急性失代償性心衰竭期間腎功能的下降與預後改善相關，支持將充血性HF生物標記納入指導中，用於解釋因急性失代償性HF入院的患者在急性期間的腎功能下降[37]。相反，sST2與腎功能無關，也與糖尿病性腎病的存在無關。這一特殊特性為評估sST2在腎功能不全患者中的預後相關性鋪平了道路。實際上，已證明sST2是一個獨立的預後標記[38, 39]，且是慢性腎病患者HF發作的預測指標[40]。

在探索特定的T2DM併發症時，NT-proBNP和hs-cTnI與神經病變、動脈粥樣硬化性血管疾病和視網膜病相關，與年齡、性別和血糖控制無關。有趣的是，一項最近的研究調查了hs-cTnI與糖尿病性神經病變之間的關聯，結果顯示，hs-TnT與坐骨神經的完整性呈負相關，且與神經病變殘疾評分呈正相關[41]。對於有MACE病史的患者，NT-proBNP和hs-cTnI水平較高，確認了儲存後樣本的完整性和病史信息的有效性。

我們對T2DM患者進行了縱向評估，以評估心臟生物標記sST2、Dimension Vista hs-cTnI和NT-proBNP是否與15年的全因死亡率和MACE的發展相關，並將整體模型適配到預測5年、10年和15年存活的預測圖中。值得注意的是，調整最相關的CV風險因子後，所有三個生物標記都能獨立預測死亡。具體來說，血清sST2濃度≥ 32 ng/mL的患者與sST2 < 16.5 ng/mL的患者相比，死亡風險增加了2.8倍。這兩個截止值是為了最大化預測的顯著性而計算的。值得注意的是，我們確定最高風險個體的截止值與預測慢性HF不良結果的35 ng/mL截止值相似[42]。雖然有關sST2在確定CVD患者中的預後價值的報告很多，但據我們所知，這是首次評估sST2在T2DM患者中的長期預後價值的研究。Tor Vergata Atherosclerosis登錄數據顯示，高sST2水平預測了399名動脈粥樣硬化疾病患者的全因和CV死亡率（中位數隨訪75個月），其中包括有T2DM受損葡萄糖耐受的受試者，這些受試者的sST2水平最高[20]。一項對T2DM和HD患者的短期（180天）隨訪研究顯示，sST2水平> 54 ng/mL與死亡風險和因心血管原因重新入院的風險較高相關[43]。另一項研究顯示，調整年齡、性別和T2DM存在後，血漿sST2水平≥ 19 ng/mL顯著預測了CAD患者MACEs和其他CV終點的發展[19]。

如預期，我們的數據確認NT-proBNP和hs-cTnI也與T2DM的全因死亡率獨立相關，儘管在涵蓋所有三個生物標記的模型中，與hs-cTnI的關聯丟失了。已證明NT‐proBNP與預測T2DM高風險患者死亡和心血管事件的20個傳統臨床和實驗室變量的模型一樣具有區分性[44]。ADVANCE試驗的次級分析顯示，在為期5年的隨訪期間，即使在對T2DM結果的已確立和新興臨床預測因子進行了廣泛調整後，NT-proBNP和hs-cTnT仍與MACE和死亡的增加風險強烈相關[45]。最後，根據觀察到這些生物標記中的每一個都與疾病的特定生化特徵相關，我們通過將對每個生物標記（低、中或高）級別的點數相加來計算出一個組合的「心臟分數」。值得注意的是，所得分數是T2DM死亡率的顯著獨立預測指標。分數≥ 8的患者，這對應於至少兩個生物標記的最高值，死亡風險增加了3.6倍，而分數在5和7之間的患者風險增加了1.8倍。該分數也與T2DM患者全因死亡和MACE的綜合終點獨立相關，而這些患者之前沒有MACE的病史。雖然這種組合方法已被廣泛報導用於已確定的CVD患者的預後分層[46,47,48]，但到目前為止，在T2DM患者的臨床異質性隊列中還沒有可用的數據。

最後，比較兩種不同的hs-cTnI方法，即Dimension Vista®和Architect i-Stat試劑，顯示了良好的一致性，對於平均hs-cTnI濃度低於40 ng/mL的偏差可以忽略不計，如在> 90%的測試樣本中觀察到的那樣。但是，必須指出，之前報導了這項研究中使用的兩種hs-cTnI方法之間存在顯著差異，涉及到免疫測定系統的分析設計、分析性能和測量的生物標記濃度，尤其是在99th百分位值方面[49]。Architect和Siemens免疫測定法之間的這些分析特性和臨床性能的差異阻止了測量的生物標記濃度的良好調和，除非應用特定的重新校準程序[50]。因此，在這項研究中，使用不同方法獲得的hs-cTnI濃度分別進行了分析。當將Architect試劑視為一個分類變量時，它與T2DM的死亡率相關，其中最高水平組的個體死亡風險增加3倍。我們的研究確認了使用Architect試劑對來自社區內動脈粥樣硬化風險（ARIC）研究的1’704名T2DM患者的hs-cTnI的評估結果，該研究顯示hs-cTnI與全因和心血管死亡風險獨立相關，並顯著提高了模型區分度[51]。

本研究有需要解決的限制。首先，入組時沒有患者使用新型抗糖尿病藥物，並且在隨訪期間其逐步採用可能對結果產生重大影響。其次，隨著時間的推移，血糖和脂質的目標得到了強制執行，從而影響了我們患者的CV風險因素的負擔。第三，沒有關於血糖控制程度的中間資訊，也沒有關於T2DM併發症的生化變數（例如尿白蛋白與肌酐比值）的資訊，以及CTR受試者的死亡結果。但是，入組的T2DM患者持續受到一家專門機構的跟踪，並堅守最新的護理標準，並定期監控併發症的發展，如失訪患者的非常小比例（1.2%）所證實的那樣。重要的是，入組時有MACE和CV藥物的先前病史的記憶資訊。樣本在整個隨訪期間收集並儲存在−80°C，並且專用的血清異位體僅用於本研究。關於CTR受試者的隨訪，將在不久的將來收集有關生存和死因的資訊，從而使我們能夠評估T2DM如何影響心臟生物標記物預測生存的能力。

結論

本研究的發現確認了sST2、hs-cTnI和NT-proBNP與2型糖尿病患者的死亡率和MACE的發生相關。它們跟踪疾病的不同特點的能力，包括胰島素抗性和相關的代謝疾病，以及它們在預測存活率方面的增值效果，支持它們在T2DM患者的隨訪中的常規評估。此外，部分克服傳統心臟生物標記物的某些限制的能力，以及CE-IVD標記的全自動化測試方法的可用性，促使將sST2作為健康個體和與增加的CV風險相關的疾病背景中的CV風險生物標記。

數據和材料的可用性

在當前研究中生成和/或分析的數據集可以根據合理的要求從相應的作者那裡獲得。

縮寫

T2DM:2型糖尿病

CV:心血管

BNP:腦利尿肽

cTn:心臟肌鈣蛋白

sST2:可溶性抑制腫瘤形成2

NT-proBNP:N-末端proBNP

CTR:對照組

UACR:尿蛋白與肌酸酐比

MACE:主要不良心血管事件

HF:心臟衰竭

OGTT:口服葡萄糖耐量試驗

eGFR:估計的腎小球過濾率

NRI:淨重新分類改進

LASSO:最小絕對收縮和選擇運營商

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