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牙周病是一種由細菌感染引起的慢性牙齦炎症，可能導致連接組織和骨骼破壞。韓國的研究者提出，利用唾液進行現場診斷牙周病的技術已逐漸可行，這將為早期診斷和治療開啟新的可能性。儘管目前還面臨一些驗證挑戰，但已確認多個有希望的唾液生物標記物，這些發現為未來牙科診斷提供了新的途徑。
Suk Ji1 Youngnim Choi2*
1Department of Periodontology, Anam Hospital, Korea University, Seoul, South Korea
2Department of Oral Microbiology and Immunology, School of Dentistry and Dental Research Institute, Seoul National University, Seoul, South Korea
Front. Cell. Infect. Microbiol., 03 September 2015
Sec. Molecular Bacterial Pathogenesis
Volume 5 – 2015 |
https://doi.org/10.3389/fcimb.2015.00065
牙周炎是由持續的細菌感染引起的牙周組織的慢性炎症，導致結締組織和骨骼的破壞。由於齒槽骨損失後牙周組織的重建能力有限，早期診斷和干預應該是牙周治療的首要目標。然而，牙周炎經常在沒有明顯症狀的情況下進展，許多患者在牙周破壞進展到無法挽回的地步之前不會尋求專業牙科護理。此外，當前對牙周炎的診斷依賴於耗時的臨床測量。因此，對於牙周炎的近患者測試存在未滿足的需求。唾液作為牙周炎的近患者診斷工具是一種理想的生物流體。近期在點護理（POC）測試方面的發展表明，現在技術上已經可行使用唾液進行牙周炎的診斷測試。已報告了多個與牙周炎相關的有前途的唾液生物標誌物。必須根據牙周炎的發病機制仔細選擇最佳生物標誌物組合。使用唾液進行牙周炎POC診斷的最大障礙可能是在大型、多樣化的患者群體中進行驗證的過程。因此，我們提議成立國際牙周病生物標誌物聯盟，集結努力識別、選擇和驗證用於牙周炎診斷的唾液生物標誌物。
唾液診斷牙周病的用途
牙周病是由持續的細菌感染引起的牙周組織的慢性炎症，導致結締組織和骨骼破壞（Ji et al., 2014）。由於其慢性特性，牙周病進展時不會在口腔中造成嚴重不適，患者通常只有在牙周組織被大量破壞後才尋求專業護理。因此，需要使用一種簡便、安全且容易獲得的方法在初期階段診斷牙周病。牙周病目前是通過X光攝影和臨床測量探針口袋深度（PD）、探針出血（BOP）和臨床附著水平（CAL）來診斷的（Salvi et al., 2008）。然而，這些傳統的臨床測量耗時且提供的信息有限，因為它們是以前牙周病的指標，而非當前病情活動的指標。此外，它們不足以預測未來可能面臨牙周病風險的易感個體。到目前為止，最好的牙齦炎症預測指標是BOP，但這種方法存在太多假陽性（Lang et al., 1990）。目前迫切需要近患者測試來診斷牙周病。
唾液是作為牙周病診斷工具的理想生物流體。唾液的收集安全、非侵入性且簡單，且可多次收集唾液，對患者的不適感最小。已經在唾液中鑒定出多個與牙周病臨床參數相關的有希望的生物標誌物（Miller et al., 2010; AlMoharib et al., 2014; Taylor, 2014）。唾液包含由宿主和細菌產生的局部蛋白質、遺傳/基因組生物標誌物如DNA和mRNA，以及各種代謝物（Cuevas-Córdoba and Santiago-García, 2014）。然而，使用唾液診斷牙周病在檢測每個單獨牙齒部位的病情活動上有限制；需要傳統的臨床測量來實現這一點。在這方面，使用唾液診斷牙周病必須實現為點護理（POC）測試。POC測試被定義為在實驗室外或患者護理現場附近進行的醫學測試，包括患者的床邊、醫生的辦公室和患者的家（Song et al., 2014）。如果使用唾液的POC設備診斷牙周病，患者可以輕鬆地在家自我診斷牙周病，並在合適的時間前往牙科診所。在牙科診所，可以輕鬆地在椅邊監控當前病情活動和治療反應。一個用於診斷牙周病的POC設備也可以幫助醫生評估患者的牙周狀態，因為牙周病與許多全身疾病有關，如動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病和類風濕性關節炎（Scannapieco, 2005; Kobayashi and Yoshie, 2015）。當醫生開處方雙膦酸鹽或其他與藥物相關的頜骨壞死（MRONJ）相關的藥物時，他們可以事先考慮患者的牙周狀態，以防止MRONJ的發展，這是與拔牙結合的藥物使用常見的併發症（Katsarelis et al., 2015）。近期POC測試的發展表明，現在技術上已經可行使用唾液診斷牙周病。
唾液診斷在牙周病的應用價值
牙周炎是由持續性細菌感染引起的牙周組織慢性炎症，導致結締組織和骨骼的破壞（Ji等人，2014）。由於其慢性特性，牙周炎在不引起口腔嚴重不適的情況下進展，患者通常只有在牙周組織遭到相當破壞後才尋求專業護理。因此，有必要使用一種簡單、安全且易於獲取的方法在其初期診斷牙周炎。目前牙周炎的診斷是使用放射線學和牙周袋探測深度（PD）、探測出血（BOP）和臨床附著水平（CAL）等臨床測量（Salvi等人，2008）。然而，這些傳統的臨床測量耗時且提供的信息有限，因為它們是早前牙周疾病而不是現在疾病活動的指標。此外，它們無法預測未來可能患牙周炎的易感個體。迄今為止，牙齦炎症的最佳預測因子是BOP，但與此方法相關的偽陽性太多（Lang等人，1990）。診斷牙周炎的近端檢測需求尚未得到滿足。
唾液是作為牙周炎診斷工具的理想生物液體。唾液的收集安全、無侵入性且簡單，並且可以重複收集，對患者造成最小的不適。唾液中已經識別出許多與牙周炎臨床參數相關的有前景的生物標記物（Miller等人，2010；AlMoharib等人，2014；Taylor，2014）。唾液包含局部產生的蛋白質、基因/基因組標記物如DNA和mRNA，以及源自宿主和細菌的各種代謝物（Cuevas-Córdoba和Santiago-García，2014）。然而，使用唾液診斷牙周炎在每個個齒位檢測疾病活動存在限制；為了完成這一點，需要傳統的臨床測量。在這方面，使用唾液診斷牙周炎必須實現為即時檢測。即時檢測是指在患者護理現場之外進行的醫療檢測，包括患者的病床邊、醫生辦公室和患者的家中（Song等人，2014）。如果使用唾液進行即時診斷牙周炎的即時檢測設備，患者可以輕鬆在家中診斷自己的牙周炎，並在適當的時間訪問牙科診所。在牙科診所，可以輕鬆地在椅邊監測當前疾病活動和對治療的反應。診斷牙周炎的即時檢測設備還將幫助醫生評估其患者的牙周狀況，因為牙周炎與許多全身性疾病（如動脈粥樣硬化、冠心病、糖尿病和風濕性關節炎）有關（Scannapieco，2005；Kobayashi和Yoshie，2015）。當醫生處方磷酸鹽類或其他與口服抗生素相關的藥物時，他們可以事先考慮患者的牙周狀況，以防止發展MRONJ，這是與拔牙相結合的常見併發症（Katsarelis等人，2015）。近期的即時檢測發展表明，使用唾液診斷牙周炎現在在技術上是可行的。
分子診斷的即時檢測技術
在生物流體中檢測生物標記信號的技術已經取得了顯著進展。特別是微流體和芯片實驗室技術的結合使得可以在即時檢測點（POC）的小體積生物液體中實時監測生物標記物（Sackmann等人，2014）。芯片實驗室方法將採樣、樣品準備、檢測和數據分析等處理步驟集成到一個小型設備中（Su等人，2015）。基於微流體的設備可以分析各種臨床樣本，包括血液、唾液、鼻液和尿液（Su等人，2015）。
POC技術檢測到的診斷目標包括核酸、蛋白質、代謝物和其他小分子（Song等人，2014；Su等人，2015）。例如，核酸可以通過芯片上的PCR（非等溫）或芯片上的等溫擴增技術進行增殖（Su等人，2015）。許多基於PCR的POC設備已經商業化，用於檢測諸如流感、RSV、HIV、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、難辨梭菌和瘧疾等病原體（Su等人，2015）。POC DNA測試也已經開發出來，用於檢測與各種癌症相關的基因突變（Yang等人，2014）。對蛋白質生物標記物的微流體檢測通常依賴於基於抗體的免疫分析。用於與高特異性和敏感性結合的各種生物分子的aptamer、DNA或RNA寡核苷酸是抗體的替代品（Toh等人，2015）。簡單的側向流動分析法快速且特異性高，但不敏感或定量。已經開發出多種新技術，以提高敏感性並允許多重蛋白質生物標記物的定量測量（Gaster等人，2009；Warsinke，2009；Rissin等人，2010；de la Rica和Stevens，2012）。葡萄糖是POC測試的最知名代謝物，已有很長的使用歷史（Wilkins和Atanasov，1996）。現在，可以使用POC技術定量測量更廣泛範圍的分析物（Sia和Chin，2011）。例如，i-STAT POC設備，每年銷售數百萬個，可以電化學地測量血氣（pH、PCO2、PO2、TCO2、HCO3、鹼過量和sO2）、電解質（鈉、鉀、氯、TCO2、陰離子間隙、游離鈣、葡萄糖、尿素氮、肌酐和乳酸）和血液學（紅細胞比容和血紅蛋白）參數（Lauks，1998）。還開發出了一種測量一氧化氮的微流體設備（Halpin和Spence，2010）。
已經開發出各種各樣的方法來檢測目標分子，但光學檢測和電化學檢測是最常採用的方法。POC設備中實施的光學檢測方法包括吸收比色法、化學發光法、螢光法、表面增強拉曼散射光譜法和表面電漿共振（Gubala等人，2012；Su等人，2015）。電化學檢測方法包括安培計、電位計和阻抗計測量（Su等人，2015）。
牙周炎的唾液生物標記物
理想的牙周炎生物標記物必須能夠（1）診斷牙周疾病的存在，（2）反映疾病的嚴重程度，（3）監測疾病對治療的反應，以及（4）預測疾病的預後/進展。已經在唾液中確定了滿足至少其中一項四個要求的多個生物標記物（表1-4）。牙周病的唾液生物標記物可以來自細菌和宿主。隨著牙周炎的進展，牙齦炎症、軟組織破壞和骨破壞依次發生，並釋放相關的蛋白質或代謝物進入唾液。因此，基於宿主的生物標記物根據它們是否反映炎症、軟組織破壞或骨破壞進行分類。在至少三個獨立研究中滿足四個要求中的三個的生物標記物被歸類為強（S）生物標記物。當報告沒有差異或矛盾結果的研究數量等於或大於支持性結果的研究數量時，生物標記物被歸類為可疑（Q）。其餘的生物標記物被歸類為潛在（P）。
表1. 來自細菌的唾液生物標記物
來自細菌的生物標記物
來自細菌的生物標記物包括DNA和蛋白質。通過針對16S rRNA基因的特定區域，確定了唾液中著名的致病性細菌水平，例如黏聚體原生體組織培養劑，三種紅色複合物種，以及幾種橙色複合物的物種（見表1）。其中，只有細菌物種Porphyromonas gingivalis，Prevotella intermedia和Tannerella forsythia已被多項研究證明為牙周炎的強生物標記物。最近使用16S rRNA基因的高通量測序識別了與牙周炎相關的新物種/類型（Griffen等人，2012；Göhler等人，2014）。鑒於牙齲生物膜的複雜性，需要研究新識別的物種/類型作為牙周炎唾液生物標記物的潛力。已證實唾液中二肽二肽酶IV的活性與牙周炎和P. gingivalis的存在有關（Aemaimanan等人，2009）。二肽二肽酶IV是一種丝氨酸蛋白酶，它從多肽鏈的N-末端剪切X-Pro二肽，從而促進膠原蛋白的降解（Banbula等人，2000）。唾液中的DPP4可能來自宿主和細菌，包括P. gingivalis（Aemaimanan等人，2009）。
宿主源性炎症生物標記物
牙周炎始於牙齲生物膜引起的牙齦組織炎症。作為唾液中的炎症生物標記物，已經研究了各種酶（精胺酶、二肽二肽酶IV、β-葡萄糖苷酶和髓過氧化物酶）、抗微生物蛋白質（乳鐵蛋白和鈣蛋白）、炎症細胞因子（IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-γ和MIP-1α）和介導炎症的蛋白質（化學物質、CRP、TLR4、可溶性CD14和降鈣素）（見表2）。特別是IL-1β、MIP-1α和精胺酶是與牙周炎炎症參數（如牙齦指數或探測出血）相關的強生物標記物（Miller等人，2006；Gheren等人，2008；Al-Sabbagh等人，2012；Rathnayake等人，2013）。除了蛋白質生物標記物外，一氧化氮、8-羥基脫氧鳥苷、血小板活化因子和脂肪酸代謝物（新研究、十二烯酸、亞麻油酸和花生四烯酸）也被識別為唾液中與炎症相關的生物標記物（見表2）。
表2. 與炎症相關的宿主源性唾液生物標記物
與軟組織破壞相關的宿主源性生物標記物
隨著牙周炎的進展，軟組織被破壞，釋放出參與組織破壞的多種酶和蛋白質進入唾液。其中，MMP-8、MMP-9、HGF、乳酸脫氫酶、天冬氨酸氨基轉移酶和TIMP-2是牙周炎的強生物標記物或潛在生物標記物（見表3）。此外，最近對唾液進行的代謝物組學分析顯示，在牙周炎中，源自大分子降解的代謝物量增加，包括二肽（蛋白質）、低聚/單醣（多糖）、溶脂質、脂肪酸和單酰甘油（甘油磷脂和三酰甘油），以及尿苷（DNA/RNA）（見表3）。
表3. 與軟組織破壞相關的宿主源性唾液生物標記物
與骨破壞相關的宿主源性生物標記物
在牙周炎中，唾液骨重塑的生物標記物可以用作骨破壞的指標。這些包括鹼性磷酸酶、骨連結蛋白、RANKL和鈣（見表4）。已報告唾液鈣水平與CAL水平呈正相關（Sutej等人，2012）。
表4. 與硬組織破壞相關的宿主源性唾液生物標記物
進一步考慮
在列出的各種唾液生物標記物中，至少有一項研究表明，P. gingivalis已滿足牙周炎理想生物標記物的所有四項要求。然而，單一生物標記物的檢測可能沒有足夠的效力進行準確的診斷，因為可能存在假陽性或假陰性結果。牙周炎是一種涉及細菌與宿主免疫系統之間複雜相互作用的疾病。結合宿主源性生物標記物（反映炎症、軟組織破壞和骨破壞）以及細菌源性生物標記物可能有助於診斷牙周炎的存在，以及疾病的進展程度和對治療的反應。許多宿主源性生物標記物已經顯示出與牙周炎的強烈相關性。
生物標記物的濃度可能受到唾液流速、昼夜節律、年齡、患者的生理狀態和其他因素的影響，這引起了使用唾液生物標記物進行診斷的準確性和可重復性的擔憂（Nový，2014）。雖然一些唾液蛋白質的非刺激和刺激樣本之間以及隨時間的相關性已經報告（Rudney等人，1985），但並未對所有唾液蛋白質組或代謝物組進行這樣的研究。儘管如此，許多生物標記物在眾多研究中已經顯示出與牙周炎的一致相關性。例如，在使用非刺激全口唾液樣本的六項研究中觀察到牙周炎中唾液中MMP-8的水平顯著高於健康對照組（Miller等人，2006；Christodoulides等人，2007；Ramseier等人，2009；Costa等人，2010；Mirrielees等人，2010；Ebersole等人，2013），在使用刺激全口唾液樣本的五項研究中也觀察到相同的現象（Gorska和Nedzi-Gora，2006；Gursoy等人，2010，2013；Meschiari等人，2013；Rathnayake等人，2013）。這些研究結果表明，如果選擇具有顯著組間差異的生物標記物，則可以克服唾液生物標記物濃度的受試者內變異，以進行診斷目的。
在牙周病學中的POC設備
一些POC設備已經開發用於牙周炎的唾液診斷。一種名為“集成微流控口腔診斷平台（IMPOD）”的設備能夠通過將樣品預處理（過濾、濃縮、混合）與電泳免疫分析和激光誘導螢光檢測系統集成，以檢測低樣品體積要求（10微升）和相當靈敏度（nM-pM）的唾液蛋白。使用該設備，可以在唾液中迅速（<10分鐘）測量MMP-8、TNF-α、IL-6和CRP（Herr等人，2007a,b）。然而，其在臨床環境中的驗證尚未報告。
德克薩斯大學奧斯汀分校的一個小組開發了一種將微流體學和基於螢光的光學系統集成的LOC系統，其中在化學敏感的珠子上進行夾心免疫分析。他們報告了LOC系統應用於多重測量三種唾液生物標記物：C-反應蛋白、MMP-8和IL-1β，這些生物標記物與牙周炎的臨床表現有關。LOC方法的檢測極限比標準ELISA低了五個量級，且LOC方法得到的結果與ELISA結果一致（Christodoulides等人，2007）。目前正在臨床試驗中研究使用此LOC方法的POC設備是否能夠準確測量唾液生物標記物MMP-8的水平，並因此指示患者是否牙周健康、牙齦炎或牙周疾病（在ClinicalTrials.gov的NCT02403297）。
建議組織國際牙周病唾液生物標記聯盟
為了成功地使用唾液進行牙周炎的 POC 诊断，重要的是要用大型人群对候选生物标记进行验证，这些人群要合适地考虑到种族、地区、性别和年龄等因素。在牙周研究中，全口或选定的牙齿已被检查以诊断牙周炎，并且不同的标准也被用来分类牙周炎的严重程度。患者分类的这种差异使得很难整合不同研究的结果。此外，唾液采样方法的变化（例如，静息 vs. 刺激、整体 vs. 单个腺体采样）、靶生物标记以及唾液生物标记的检测方法阻止了从不同研究或中心获取的数据的直接比较。我们提议组织一个国际牙周病唾液生物标记联盟（ICSBP）。ICSBP 可以提出协作努力，制定临床研究的标准化方案，包括牙周炎的临床诊断的统一方法。此外，ICSBP 可以通过共享临床样本和经验来加速生物标记的验证和唾液诊断的实施。
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