新研究發現：NT-proBNP生物標記可助於評估心絲蟲病犬隻的肺高壓

本翻譯僅作學術交流用，無商業意圖，請勿轉載，如有疑議問請來信

近期研究顯示，N末端前B型利尿肽（NT-proBNP）在心絲蟲病犬隻中的濃度顯著增加，特別是在有肺動脈高壓的犬隻中。這項發現提供了使用NT-proBNP作為非侵入式診斷工具的可能性，以便更準確地評估受感染犬隻的肺動脈高壓，從而改善診斷、治療及預後評估。

Noelia Costa-Rodríguez, Sara N. García-Rodríguez, Jorge I. Matos, Yaiza Falcón-Cordón, Rodrigo Morchón, José A. Montoya-Alonso & Elena Carretón

https://parasitesandvectors.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13071-023-05873-3

Abstract

In recent years, the usefulness of echocardiography and serum biomarkers in the diagnosis of pulmonary hypertension (PH) in dogs with heartworm disease has been studied. Previously, N-terminal pro B-type natriuretic peptide (NT-proBNP) has shown high concentrations in dogs with heart disease and/or PH as well as its usefulness as a prognostic indicator, but it has never been evaluated in the diagnosis and prognosis of PH in dogs with heartworm disease. The aim was to evaluate the serum concentrations of NT-proBNP in dogs infected by Dirofilaria immitis to determine its usefulness as a tool to detect precapillary PH.

NT-proBNP was determined in 50 heartworm-infected dogs. Presence/absence of PH was determined echocardiographically, using the Right Pulmonary Artery Distensibility Index (RPAD Index) and the systolic flow of tricuspid regurgitation mainly, together with other echocardiographic measurements following the guidelines of the American College of Veterinary Internal Medicine (ACVIM) for the diagnosis of PH. Other epidemiological parameters (breed, age, sex, status: client-owned or shelter dogs) and clinical parameters (microfilaremia, parasite burden, presence of symptoms, body condition) were collected as well.

Moderate-severe PH was present in 40% of the dogs (RPAD Index < 29.5%), NT-proBNP concentrations being significantly higher compared with dogs that did not have PH. A cutoff for NT-proBNP of ≥ 1178.45 pmol/l showed a sensitivity of 64.3% and a specificity of 95.5% for the presence of moderate-severe PH. Older dogs and dogs from shelters showed significantly higher NT-proBNP concentrations. Dogs with symptoms and low body condition presented significantly higher NT-proBNP concentrations as well.

The determination of NT-pro-BNP concentration can be a useful tool in the diagnostic work-up of dogs with heartworm disease and associated PH and can help to identify animals in the more advanced stage of this disorder.

摘要

近年來，心臟超聲檢查和血清生物標誌物在診斷心絲蟲病犬隻的肺高壓（PH）中的實用性已經被研究。以前，N末端前體B型利尿肽（NT-proBNP）在心臟疾病和/或PH的犬隻中顯示出高濃度，以及其作為預後指標的實用性，但從未在心絲蟲病犬隻的PH診斷和預後中進行評估。目的是評估感染了心絲蟲（Dirofilaria immitis）的犬隻的血清NT-proBNP濃度，以確定其作為檢測前毛細管PH的工具的實用性。

在50隻感染心絲蟲的犬隻中測定了NT-proBNP。使用右肺動脈可塑性指數（RPAD指數）和主要的三尖瓣返流收縮期流量，結合其他按照美國獸醫內科學院（ACVIM）診斷PH的指南進行的心臟超聲測量，以超聲檢查的方式確定PH的存在/缺席。同時收集了其他流行病學參數（品種、年齡、性別、狀態：客戶所有或收容所犬隻）和臨床參數（微絲蟲症、寄生蟲負擔、症狀存在、體况）。

40%的犬隻存在中度至重度PH（RPAD指數<29.5%），NT-proBNP濃度與沒有PH的犬隻相比顯著較高。NT-proBNP的截斷值≥1178.45 pmol/l，對於中度至重度PH的存在具有64.3%的敏感性和95.5%的特異性。老年犬和來自收容所的犬隻顯示出顯著更高的NT-proBNP濃度。有症狀和低體况的犬隻也顯示出顯著更高的NT-proBNP濃度。

測定NT-proBNP濃度可以是診斷心絲蟲病和相關PH犬隻的有用工具，並且可以幫助識別處於此疾病更高級階段的動物。

圖形摘要

背景

心絲蟲病由線蟲Dirofilaria immitis引起，是一種蟲媒傳播疾病，分布廣泛。雖然狗和野生犬科動物是終宿主，但包括人類在內的其他物種也可能被感染。感染的狗在較輕微的感染中可能保持無症狀，或可能表現出輕微的咳嗽，而在嚴重的感染中，它們通常表現出嚴重的臨床徵象，如體重減輕、呼吸困難、腹水和昏厥，這是一種危及生命的疾病。成年蟲位於肺動脈中，導致增生性內膜炎；這些血管變化從蟲到達後不久就開始，並表現為血管炎症、內皮損傷、脫落和內膜的絨毛狀增生等。這種情況導致動脈的彈性降低和阻力增加，長期可能導致肺高壓（PH）的發展，並在某些情況下也可能導致右側充血性心力衰竭。

PH是一種在多種心血管、呼吸系統和全身疾病中出現的血液動力學和病理生理狀態。特別是，心絲蟲病會產生前毛細管起源的PH，這被定義為肺血管系統動脈側的病理異常所導致的結果。雖然PH診斷的金標準是直接通過右心導管術測量收縮期肺動脈壓，但在獸醫和人類醫學中，目前通過心臟超聲來確定診斷。

然而，心臟超聲仍是PH估計的間接方法，存在使這種狀態難以診斷的限制。因此，人們不斷尋找不同的非侵入性診斷方法來進行PH的確定，如不同血清生物標誌物的測定。在這些生物標誌物中，已經在狗和人中評估了N末端前體B型利尿肽（NT-proBNP）的濃度。腦利尿肽（BNP）作為前體荷爾蒙存在，回應心室肌細胞伸展在進入血液循環前被裂解為非活性的N末端片段和生物活性荷爾蒙BNP。NT-proBNP具有更長的壽命，通常作為生物活性形式的替代標誌物使用。先前的研究表明，NT-proBNP血清濃度作為診斷和監測充血性心力衰竭以及間接監測狗和貓的心肌功能的優秀生物標誌物，並且在由於嚴重二尖瓣返流引起的左心衰竭後的毛細管PH的狗中描述了升高的NT-proBNP濃度。傳統上，左心室被認為是BNP的主要來源，右心室貢獻較小。然而，在人和狗中，已經描述了存在前毛細管PH時增加的NT-proBNP濃度，這可能有助於分層疾病的嚴重程度，監測對治療的反應，並作為預後的指標。因此，本研究的目的是評估感染D. immitis的狗的血清NT-proBNP濃度，以確定其作為檢測前毛細管PH的工具的實用性。

摘要

這項前瞻性研究包括了50隻感染心絲蟲的犬隻，這些犬隻在2021年9月至2022年7月期間被帶到位於高發地區的拉斯帕爾馬斯大學獸醫教學醫院。心絲蟲病的診斷是通過使用商業酶聯免疫吸附試劑盒（Uranotest Dirofilaria, Urano Vet SL, 巴塞羅那，西班牙）來檢測循環抗原，按照製造商的指導進行的。此外，使用修改的Knott試驗來評估微絲蟲的存在/缺席。

為每個動物保留了完整的記錄，包括人口學和流行病學數據（品種、性別、年齡、狀態：客戶擁有或收容所犬隻）。所有犬隻都接受了病史和完整的體格檢查。如果觀察到一個或多個與心絲蟲病相關的症狀（呼吸困難、咳嗽、運動耐受力差、虛弱、體重減輕和昏厥）以及與右側充血性心力衰竭相關的症狀（腹水、頸靜脈擴張和肝腫大），則被認為是有症狀的感染犬隻。它們的體况是根據九點體况評分（BCS）系統確定的，總是由同一位研究人員進行。

納入標準是：犬隻之前沒有接受過心絲蟲化學預防，犬隻尚未開始對D. immitis的任何治療，並且動物主人提供了同意將犬隻納入研究的知情同意。有合併心肺疾病（即左心疾病、擴張型心肌病、先天性疾病、慢性呼吸系統疾病）的犬隻，通過臨床病史、病史、臨床發現和額外的診斷測試檢測到，被排除在研究之外。此外，為了排除氮質血症、貧血或系統性高血壓對NT-proBNP濃度的任何影響，血清肌酐和/或血尿素氮（BUN）濃度異常、血液學分析顯示貧血跡象或收縮壓>160 mmHg（通過振蕩法測量）的犬隻也被排除在研究之外。

所有犬隻都接受了心臟超聲檢查，使用帶有頻譜和彩色多普勒以及多頻探頭的超聲設備（2.5–10 MHz, Viviq Iq®, General Electric, Boston, MA, USA）。所有犬隻在檢查期間都是意識清醒的，輕柔地固定在右側和左側側臥位並在心電圖監測下。所有記錄都由同一位研究員完成。根據美國獸醫內科學院（ACVIM）的指南確定PH的存在/缺席。使用右肺動脈可塑性指數（RPAD指數）和三尖瓣返流收縮期流量等作為主要測量方法，如之前所述。其他進行的心臟超聲測量包括三尖瓣返流壓力梯度（TRPG）、肺幹與主動脈比率（PT:Ao）、全球組織多普勒成像（G-TDI）指數、三尖瓣環平面收縮位移（TAPSE）、肺靜脈與肺動脈比率（PV:PA）、右心室加速時間（AT）、右心室射血時間（ET）、AT:ET比率、右心房面積指數（RAAi）和右心室舒張末期面積指數（RVEDAi）。

對於RPAD指數和PV:PA比率，將犬隻放在右側側臥位；探頭放置在第三肋間空間，並將光束朝向後方和背面方向。在最大直徑處測量肺動脈的收縮期直徑，並在最小直徑處測量舒張期直徑。根據先前作者的方法計算肺動脈的直徑。對於測量三尖瓣返流收縮期流量、TRPG、PT:Ao比率、G-TDI、TAPSE、AT、ET、AT:ET比率、RAAi和RVEDAi，使用頂四腔視圖和左前橫切視圖。

對於每個測量，記錄了三個連續的心臟周期。當出現RPAD指數<29.5%、三尖瓣返流收縮期流量>3.4 m/s、TRPG<30 mmHg、PA:Ao比率>1.05–1.23、AT>5.50±0.31、ET>10.6±0.14、AT:ET比率<0.30、G-TDI>11.8±8.50、RVEDAi>4.9–10.9 cm2/m2、RAAi>4.2–10.2 cm2/m2和TAPSE>4.78–7.64的值時，動物被分類為存在中度-重度PH。根據之前的指南，通過心臟超聲確定寄生蟲負擔，根據1到4的分數對負擔進行評分，分數1和2被認為是低寄生蟲負擔，分數3和4是高寄生蟲負擔。

或確定NT-proBNP濃度時，從頭靜脈採集血液樣本，放置於血清管中，以1432 g的力量離心10分鐘。樣本在分析前保持冷藏，始終在接下來的2小時內完成。NT-proBNP的測量使用了VCHECK免疫層析分析儀（Bionote, Big Lake, MN, USA），此設備已經為犬類物種進行過驗證[28]。製造商為健康狗設定的參考值為<900 pmol/l，基於暗示心臟疾病的值[28]。

統計分析使用商業軟體（BM SPSS® Statistics 25.0, New York, USA）進行。對於分類變量（品種、性別、法律地位、BCS、症狀、微絲蟲存在/不存在、寄生蟲負載、肺動脈高壓存在/不存在），分析頻率和百分比；對於連續變量（年齡、NT-proBNP濃度），顯示標準差、中位數和四分位範圍。對於連續變量，組間參數差異通過Mann-Whitney/Kruskall-Wallis檢驗（非參數）或t-Student/ANOVA（參數）進行評估，基於變量正態性通過Shapiro-Wilks檢驗評估。對於分類變量，差異通過Pearson非參數卡方檢驗評估。對於多重比較，當識別出顯著差異時，使用Pearson的P檢驗進行配對比較並進行Bonferroni校正。所有對比均伴有效應大小估計器以完成結果解釋。對於分類變量，使用Cramer的V；對於連續變量，使用Cohen的D。接收操作特徵（ROC）曲線分析用於確定預測RPAD指數<29.5%（中度或重度肺動脈高壓）的最優截止值。對於所有分析，P<0.05被認為具有統計學意義。使用NT-proBNP濃度的ROC曲線結果來估計患有肺動脈高壓（RPAD指數<29.5%）的事件，並評估通過Youden指數最大化敏感性和特異性的參數截止點。

對於本研究，由於所有血液樣本均為官方診斷和監測目的而常規收集後提供本研究使用，因此不需要倫理批准。研究根據現行西班牙和歐洲關於動物保護的法律進行。

結果

研究中大多數的狗是雜種（58％，n = 29），而42％（n = 21）是純種狗。最具代表性的純種狗包括加那利獵犬、德國牧羊犬、西伯利亞哈士奇和吉娃娃。女性的比例高於男性（分別為54％與46％）。研究中狗的平均年齡為4.6歲，範圍從1歲到14歲不等。根據其法律地位，72％（n = 36）是客戶擁有的狗，28％（n = 14）來自動物收容所。關於體重狀況，狗被分類為非常瘦/過輕（BCS 1到3）（24％，n = 12），正常體重（BCS 4-5）（64％，n = 32）或超重/肥胖（BCS 6到9）（12％，n = 6）[17]。

症狀存在於38％（n = 19）的狗中。當檢測微絲蟲血症時，48％（n = 24）的狗有微絲蟲血症，52％（n = 26）的狗沒有微絲蟲血症。關於寄生蟲負荷，50％（n = 25）的狗被確定為高負荷，另外50％（n = 25）的狗被確定為低負荷。

根據PH的存在與否，狗被分為兩組。40％（n = 20）的狗中存在中度至嚴重的PH，而60％（n = 30）的狗中PH較輕或不存在。具有PH的狗的平均RPAD指數為20.1％，而沒有PH的狗的平均RPAD指數為40.6％。所有三尖瓣逆流收縮期流速> 3.4 m/s的狗已顯示出RPAD指數< 29.5％。就PH狀態而言，根據品種或性別並未觀察到顯著差異，儘管結果表明，具有中度至重度PH的狗顯著較年長（曼-惠特尼檢驗，U = 456.50，Z = -3.82，P = 0.002）。基於其法律地位，當與PH狀態進行比較時，兩組之間觀察到顯著差異（ANOVA，F = 14.84，P = 0.034）。微絲蟲血症（卡方檢驗，X2 = 1.09，df = 1，P = 0.297）或寄生蟲負荷（卡方檢驗，X2 = 1.33，df = 1，P = 0.248）對PH的存在/不存在並未在統計學上產生影響（P> 0.05）。

就NT-proBNP濃度而言，根據品種或性別並未觀察到顯著差異。具有病理濃度的狗（> 900 pmol/l）與NT-proBNP濃度在參考值內的狗相比顯著較年長[8.1（7.2-8.9）年與6.5（5.7-7.4）年]（ANOVA，F = 13.52，P = 0.002）。微絲蟲血症或寄生蟲負荷也未受NT-proBNP濃度結果的統計影響。具有PH的狗的NT-proBNP顯著高於沒有PH的狗（2004.5 pmol/l，1249.5-2759.4 pmol/l與689.9 pmol/l，528.5-851.2 pmol/l）（ANOVA，F = 13.28，P = 0.001）。此外，具有PH的狗的NT-proBNP濃度顯著高於參考值，而具有輕度或不存在PH的狗的NT-proBNP與參考值之間沒有顯著差異。

NT-proBNP濃度在具有症狀的狗中顯著較高（1749.8 pmol/l，1176.5-2323.1 pmol/l），比沒有症狀的狗高三倍以上（573.1 pmol/l，233.8-912.4 pmol/l）（ANOVA，F = 13.50，P = 0.001）。在體重較低的狗中（1478.8 pmol/l，1105.2-1852.3 pmol/l），NT-proBNP濃度也顯著高於正常體重（923.5 pmol/l，631.4-1215.6 pmol/l）或超重/肥胖的狗（819.2 pmol/l，602.26-1036.24 pmol/l）（ANOVA，F = 5.83，P = 0.02）。

使用由製造商提供的健康狗NT-proBNP參考值（900 pmol/l）作為截止值，NT-proBNP檢測PH的敏感性為64.3％，特異性為86.4％。對於確定中度至嚴重PH的存在，截止值≥1178.45 pmol/l顯示出64.3％的敏感性和95.5％的特異性。用於估計PH存在的NT-proBNP濃度的ROC曲線下面積（AUC）為中等（0.747，95％CI：0.543，0.950，Youden’s J統計值0.597）。

討論

許多在患有心臟疾病的狗中評估的生物標誌物也被評估為診斷PH的工具，其中包括NT-proBNP。許多研究探討了左心室功能障礙和/或小血管前PH的狗中的NT-proBNP濃度[16, 29]，儘管在獸醫醫學中只有少數研究簡要描述了NT-proBNP濃度在患有小血管前PH的狗中的升高[7, 16]。然而，在人類中已經很好地研究了NT-proBNP濃度在小血管前PH存在時顯著升高，這會導致右心室應激和壓力超載，從而從右心室心肌釋放BNP [10, 17, 18]。此外，在人類中，NT-proBNP濃度的增加已與小血管前PH的存在和嚴重程度相關聯，並且NT-proBNP濃度作為診斷支持、監測治療反應的工具以及預後死亡的預測指標 [17, 18, 30]。

本研究的結果顯示了這種生物標誌物在幫助確定感染D. immitis的狗中PH存在的效用，與其他作者在因其他來源的病理引起的小血管前PH狗中報告的結果一致[7]。雖然PH是心絲蟲感染中的嚴重且頻繁的現象，而且即使寄生蟲被消除，這也可能是不可逆轉的[31]，但據我們所知，這種生物標誌物對於檢測和評估PH的用途從未對這種疾病進行過評估。僅有一項已發表的研究評估了心絲蟲病狗的NT-proBNP，描述了在疾病的慢性階段（III和IV類）的病理性濃度，這有助於幫助確定嚴重程度狀態[32]。儘管該研究未評估PH，但可能解釋NT-proBNP增加的關鍵因素是PH的存在、心臟損傷和肺血栓栓塞。此外，一項較老的研究建立了另一種類似利尿肽——心房利尿肽（ANP）濃度升高與狗的輕度心絲蟲感染存在之間的關係[33]。此外，其他生物標誌物已經顯示了它們在確定D. immitis感染狗的PH方面的有用性，例如，內皮素-1、C-反應蛋白和其他急性相蛋白[34,35,36,37]。

為了檢測PH的敏感性和特異性，設定了1178.75 pmol/l的截止點（分別為64.3％和95.5％），而實驗室設定的900 pmol/l的截止點的敏感性和特異性較低（分別為64.3％和86.4％）。這些結果與其他作者展示的結果不同，對於900 pmol/l的NTproBNP濃度截止點，其敏感性和特異性分別為91.7％和62.5％[7]。這可能是由於所使用的方法不同，突出了使用不同的NT-proBNP分析儀以及使用其他超聲心動圖指標來估計PH存在的重要性。鑒於實驗室提供的參考值是基於心臟損傷的診斷，因此1178.75 pmol/l的值可能對於幫助確定PH的存在/不存在很有趣，尤其是由於在該研究中對該截止點的高特異性。

結果表明，較老的狗患PH的發生率較高，因此NT-proBNP值顯著較高，可能是因為較老的狗有較多的慢性感染，因此有較嚴重和先進的血管損傷。同樣，來自收容所的狗呈現較高的NT-proBNP值，可能是因為它們主要是生活質量較差，並且通常來自鄉村地區，在那裡它們通常被用作工作動物（例如狩獵或護衛犬），並且在戶外生活而沒有預防蚊子叮咬[38]。

然而，在微絲蟲血症和非微絲蟲血症的狗之間，未觀察到顯著的利尿肽濃度變化以及PH的存在/不存在。這些結果與之前的研究類似，該研究未觀察到微絲蟲存在與PH存在之間的關係[23]。這些結果同樣適用於寄生蟲負荷，與PH存在或NT-proBNP升高沒有直接關係。儘管在這方面仍然存在分歧，但這些結果與之前的研究一致，該研究表明寄生蟲負荷不是發展嚴重增生性動脈炎的決定性因素[23, 27, 39]。

有症狀的患者顯示的NT-proBNP值比無症狀患者高三倍以上。這可能是因為有症狀的狗通常呈現更先進和慢性階段的疾病；因此，可以預期PH嚴重程度更高。這些結果同樣適用於體重過低的狗，其也顯示出顯著較高的NT-proBNP值，這可能是由於患有HW的狗在更進階階段會出現的特徵性體重減輕。然而，另一項研究並未發現按體重計算的PH存在與否有所不同，因此有必要就此進行更多研究[37]。

結論

NT-pro-BNP濃度的確定可以成為診斷心絲蟲病和相關PH的狗的工具，在確定這種疾病更先進階段的動物方面發揮作用。評估狗的心肺狀況是選擇特定治療方案並提供準確預後的決定性因素，因此確定NT-proBNP可能在這方面非常有幫助。需要進行進一步的大量動物研究，以確定診斷的最佳截止值，並評估其在預後水平上的效用，就像在人類中已經建立的那樣。

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