揭秘生命之門：內皮細胞糖萼的神秘面紗

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內皮細胞糖萼，一層微妙而複雜的膜綁定網絡，覆蓋於血管內皮。本研究深入探討了其組成、功能及對血管疾病的影響。糖萼在血管生理學和病理學中扮演關鍵角色，包括影響機械傳導、止血、以及血細胞與血管壁的交互作用。此外，研究強調了對糖萼可靠可視化的需求，這是理解其複雜作用的關鍵。

內皮細胞糖萼：組成、功能與可視化

The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization

Reitsma S, Slaaf DW, Vink H, van Zandvoort MA, oude Egbrink MG. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 2007 Jun;454(3):345-59. doi: 10.1007/s00424-007-0212-8. Epub 2007 Jan 26. PMID: 17256154; PMCID: PMC1915585.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1915585/

Abstract

This review aims at presenting state-of-the-art knowledge on the composition and functions of the endothelial glycocalyx. The endothelial glycocalyx is a network of membrane-bound proteoglycans and glycoproteins, covering the endothelium luminally. Both endothelium- and plasma-derived soluble molecules integrate into this mesh. Over the past decade, insight has been gained into the role of the glycocalyx in vascular physiology and pathology, including mechanotransduction, hemostasis, signaling, and blood cell–vessel wall interactions. The contribution of the glycocalyx to diabetes, ischemia/reperfusion, and atherosclerosis is also reviewed. Experimental data from the micro- and macrocirculation alludes at a vasculoprotective role for the glycocalyx. Assessing this possible role of the endothelial glycocalyx requires reliable visualization of this delicate layer, which is a great challenge. An overview is given of the various ways in which the endothelial glycocalyx has been visualized up to now, including first data from two-photon microscopic imaging.

Keywords: Endothelial glycocalyx, Endothelial surface layer, Heparan sulfate, Hyaluronic acid, Vascular disease, Optical imaging, Two-photon microscopy

摘要

本綜述旨在介紹有關內皮細胞糖萼組成和功能的最新知識。內皮細胞糖萼是一種由膜結合的蛋白聚糖和糖蛋白網絡，覆蓋於內皮細胞的腔內側。內皮細胞和血漿衍生的可溶性分子均整合到這一網狀結構中。在過去的十年中，人們對糖萼在血管生理學和病理學中的作用有了更深入的了解，包括機械傳導、止血、信號傳遞以及血細胞-血管壁相互作用。本文還回顧了糖萼對糖尿病、缺血/再灌注和動脈粥樣硬化的貢獻。來自微循環和大循環的實驗數據暗示糖萼對血管的保護作用。評估內皮細胞糖萼可能的作用需要可靠地可視化這一精細層，這是一個巨大的挑戰。本文概述了迄今為止內皮細胞糖萼的各種可視化方法，包括來自雙光子顯微成像的首批數據。

關鍵詞：內皮細胞糖萼、內皮細胞表面層、肝素硫酸鹽、透明質酸、血管疾病、光學成像、雙光子顯微鏡

引言

內皮細胞糖萼在大約40年前就已經由Luft利用電子顯微鏡觀察到了[66]。然而，對這層結構的組成和功能仍然所知甚少。在過去的幾十年中，人們越來越認識到它在血管生理學和病理學中的重要性，如2000年Pries等人的綜述[86]以及其他更近期的綜述[4, 74]所描述的。對糖萼的（病理）生理作用的興趣始於對毛細血管管狀血液比容低且變化大的觀察，這取決於血管系統的代謝和藥理激活水平[51, 52, 63, 83, 101]。代謝和激動劑引起的紅血球速度增加與管狀血液比容之間的關係部分可以通過血漿攤薄作為Fåhraeus效應的直接延續來解釋[83]。然而，這種關係在用肝素酶（一種分解糖萼中肝素硫酸鹽的酶）局部處理微血管後解除了[17]。這一發現與理論預測一致，理論預測在內皮上方有一層1.2微米厚的緩慢移動的血漿層[51]。體內研究顯示肌肉毛細血管中的糖萼為大約0.5微米厚，覆蓋在內皮細胞上，決定大分子、紅血球和白血球的管腔域[129]。更近期的研究表明，糖萼厚度隨血管直徑增加而增加，至少在動脈系統中是如此，小動脈中範圍為2至3微米[125]，頸動脈中為4.5微米[67]。

迄今為止，許多研究表明內皮細胞糖萼在許多（病理）生理角色中的作用；除了調節毛細血管紅血球充盈外，糖萼可能影響血管系統的許多其他（失）功能。雖然目前認為血管內皮細胞在“呈現血管投射的每一種病理中都積極參與”[28]，但同樣的說法可能也適用於糖萼。評估內皮細胞糖萼可能的涉及需要可靠地可視化這一精細層，這是一個巨大的挑戰。本綜述提供了目前對內皮細胞糖萼組成和功能的基本認識，並概述了迄今為止對其進行的各種可視化方式。

組成

內皮細胞糖萼是一層富含碳水化合物的層，覆蓋於血管內皮上。它被認為通過幾種“主幹”分子連接到內皮上，主要是蛋白聚糖和糖蛋白。這些形成一個網絡，其中包括血漿或內皮衍生的可溶性分子。更靠近血管腔的部分，糖萼由可溶性血漿成分形成，這些成分直接相互連接或通過可溶性蛋白聚糖和/或糖胺聚糖（將在下文中討論）連接。在這層可溶性成分和流動血液之間存在一種動態平衡，不斷影響糖萼的組成和厚度。此外，糖萼還會受到酶解或剪切引起的脫落。生物合成和脫落之間的動態平衡使得很難從幾何上定義糖萼[62]。膜結合的蛋白聚糖、糖蛋白和糖胺聚糖網絡的組成，以及相關血漿蛋白和可溶性糖胺聚糖的組成，不能視為靜態圖像。相反，這一層整體—也被稱為內皮細胞表面層(ESL) [86]—非常動態，膜結合分子不斷被替換，並且本地合成和相關元素之間沒有明確的界限；膜結合的透明質酸可能達到>1微米的長度。直接可視化技術（見可視化技術部分）未能清楚地展示糖萼內部的成分差異，從內皮膜到血管腔，而更多地表明內皮細胞糖萼類似於一個複雜的、自我組裝的3D多糖網絡。其任何成分的酶解移除都會顯著影響糖萼的特性，這說明考慮糖萼所有成分作為一個整體的協同互動的重要性。因此，在本綜述中，我們將使用（內皮細胞）糖萼一詞來指稱整個層（圖1），並在討論其不同元素時盡可能具體。

圖1

內皮細胞糖萼的示意圖，展示其主要組成部分。左側：內皮細胞糖萼可在體內作為紅血球排斥區被觀察到，位於血管內皮的腔內側。它由膜結合和可溶性分子組成。右側：內皮細胞糖萼的組成部分。與內皮膜結合的是蛋白聚糖，帶有長的非分支糖胺聚糖側鏈（GAG鏈）和糖蛋白，帶有短的分支碳水化合物側鏈。這個網格中和上面包含了血漿和內皮衍生的可溶性成分，包括透明質酸和其他可溶性蛋白聚糖（例如，血栓調節蛋白）以及各種蛋白質，如細胞外超氧化物歧化酶（ec-SOD）和抗凝血酶III（AT III）。這些成分共同形成了內皮細胞糖萼，作為血漿和內皮之間的屏障，並在血漿和血管壁的恆定性中發揮各種作用。請注意，此圖未按比例繪製；其目的是為了說明糖萼的組成。

接下來，將提供有關內皮細胞糖萼各個組成部分的最新知識。儘管許多分子已被識別為糖萼的一部分，但有關其分佈的信息仍然稀少；如果有，這些知識大多是間接且非定量獲得的。

蛋白聚糖通常被認為是糖萼中最重要的“主幹”分子。它們由一個核心蛋白質組成，一個或多個糖胺聚糖鏈與之相連。在蛋白聚糖核心蛋白質方面，存在著明顯的變化，包括其大小、附著糖胺聚糖鏈的數量，以及它們是否與細胞膜相結合（表1）。聯繫素（syndecans，數量=4）和膠狀蛋白（glypicans，數量=6）的核心蛋白群通過跨膜域（聯繫素）或糖基磷脂酰肌醇錨（膠狀蛋白）牢固地連接到細胞膜上[12, 25]。其他蛋白聚糖，如mimecan、perlecan和biglycan，在其組裝和糖胺聚糖鏈修飾後分泌[44, 50]。這導致了可溶性蛋白聚糖的產生，它們存在於糖萼中或擴散到血流中。

表1

血管內皮細胞糖萼中蛋白聚糖核心蛋白的特性

蛋白聚糖在其糖胺聚糖鏈的結合上具有多樣性，意味著一個核心蛋白可以包含不同類型的糖胺聚糖鏈。在不同的情況和刺激下，各種鏈的比例可能會改變[89]。因此，根據一種類型的糖胺聚糖命名蛋白聚糖有些誤導。例如，聯繫素-1蛋白聚糖經常被稱為肝素硫酸鹽蛋白聚糖，而實際上，它通常包含相似數量的肝素硫酸鹽和硫酸軟骨素鏈[70]。

有五種類型的糖胺聚糖鏈：肝素硫酸鹽、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸角蛋白和透明質酸（或透明質酸）。它們是不同長度的雙糖直鏈聚合物，通過硫化和/或（去）乙醯化在不同程度上進行修飾。每個雙糖由一個尿酸和一個己糖胺組成；糖胺聚糖的分類取決於哪種尿酸或己糖胺被合成以及硫化模式（表2）。這五種糖胺聚糖均已被廣泛研究和評論[22, 27, 57, 58, 114]。硫酸皮膚素通常被視為一個單獨的糖胺聚糖類別，儘管它實際上是B型硫酸軟骨素。兩者之間的區別在於硫酸皮膚素中葡萄糖酸可能發生表旋轉，轉化為艾杜酸，這對功能性有重要的影響。在可能的情況下，我們將嘗試盡可能準確地區分這兩者；在其他地方，它們將被統稱為硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。

表2

各種糖胺聚糖鏈中雙糖的組成

在血管中，肝素硫酸鹽蛋白聚糖大約占糖萼中蛋白聚糖總量的50-90％[43, 86]。然而，這一數字是變化的，因為內皮細胞對蛋白聚糖的表達取決於各種刺激。例如，聯繫素的表達模式受到嚴格調控，隨著內皮細胞的激活或不同趨化因子的刺激而變化[119]。內皮細胞糖萼中第二常見的糖胺聚糖是硫酸軟骨素/硫酸皮膚素。報告稱，血管內皮中肝素硫酸鹽和硫酸軟骨素的存在比例大約為4:1[70, 90]。血管中硫酸角蛋白糖胺聚糖的表達及其在（病理）生理學中的重要性尚未充分了解。糖萼中另一個重要的糖胺聚糖是透明質酸。這種長的聚合分子（高達104 kDa）與其他糖胺聚糖不同，它不與核心蛋白相連。它與細胞膜的確切連接方式尚不清楚，但它可以與受體CD44結合[72]。另一種可能是透明質酸附著於其組裝蛋白，即透明質酸合酶[135]，它們位於細胞膜的胞內側。另一種可能是透明質酸（部分地）根本不直接與膜結合。它能形成極其粘稠的溶液[57]。最近，已經發現了細胞內透明質酸結合蛋白，如cdc37[31]和P32[15]，這表明這種糖胺聚糖在細胞內具有作用[23, 58]。

含有肝素硫酸鹽和硫酸軟骨素/硫酸皮膚素的蛋白聚糖在內皮細胞的內質網和高爾基體內產生。在核糖體翻譯核心蛋白後，一種木糖基轉移酶將來自尿嘧啶二磷酸木糖的木糖(Xyl)轉移到核心蛋白中的特定絲氨酸殘基(Ser)上。富含木糖的核心蛋白被運輸到順面高爾基體，一型和二型半乳糖基轉移酶將兩個半乳糖基團(Gal)添加到木糖上，然後，一型葡萄糖醛酸基轉移酶添加葡萄糖醛酸，從而完成糖胺聚糖鏈的初級連接器：-GlcA-β3-Gal-β3-Gal-β4-Xylβ3-[Ser]。

在形成初級連接器之後，接下來的步驟決定了將形成哪種類型的糖胺聚糖鏈。在肝素硫酸鹽的情況下，添加一個α4-葡萄糖胺；在硫酸軟骨素和硫酸皮膚素的情況下，添加一個β4-半乳糖胺，並且連接器中的兩個半乳糖殘基可能被硫化。從這一點開始，葡萄糖醛酸和葡萄糖胺被連接到核心蛋白上。在鏈聚合後，生長中的糖胺聚糖鏈將經歷包括N-硫化、O-硫化和表旋轉等修飾。後者將葡萄糖醛酸殘基轉變為艾杜酸殘基，並將任何硫酸軟骨素鏈轉變為B型硫酸皮膚素。這些鏈修飾在順面和反面高爾基體中進行，確定了蛋白聚糖及其每個側鏈的最終類型和功能。相比之下，透明質酸是在細胞膜的胞內側組裝的，之後不進行修飾。因此，它不含硫酸基團或修飾模式。

由於糖胺聚糖鏈包含眾多與血漿衍生蛋白的特定結合位點，小的鏈修飾可能具有重大的功能後果。對糖胺聚糖鏈內個別糖單位的連續酶促修飾使蛋白聚糖具有獨特的功能。典型地，每個雙糖可能存在16-48種不同的硫化模式，由於功能域通常被假定為通常為五糖到十糖長，因此在六糖背骨上理論上可能存在163=4,096種不同的硫化模式，這種結構多樣性對應於糖胺聚糖的多樣化生物功能。事實上，已經顯示出修飾模式隨時間和在不同的（病理）生理刺激下變化[4, 131]。糖胺聚糖硫化模式的多樣性及其對特定蛋白質結合和調節蛋白質功能的影響表明，減少糖萼厚度或調節蛋白質特異性糖胺聚糖硫化模式和電荷的條件可能會調節血管通透性，並改變特定蛋白質的結合和活性。

除了具有長的線性側鏈的蛋白聚糖外，某些糖蛋白也被視為將糖萼與內皮細胞膜連接的“主幹”分子。這組內皮細胞糖蛋白以相對較小（2-15個糖殘基）且分支的碳水化合物側鏈為特徵，包括一些已經被密集研究的分子；將在下文中更詳細討論的主要類別是內皮細胞黏附分子和凝血及纖溶系統的組成部分。詳盡地討論內皮細胞可以表達的所有糖蛋白超出了本文的範圍。此外，應該意識到，內皮細胞膜上糖蛋白的表達水平隨細胞激活或刺激而大幅變化。

內皮細胞黏附分子是已經明確定義的糖蛋白，它們在血流中的細胞招募和細胞信號傳導中發揮重要作用。內皮細胞糖萼中存在的三個細胞黏附分子家族是選擇素家族、整合素家族和免疫球蛋白超家族。

選擇素家族的糖蛋白含有一個細胞質尾部、一個跨膜區域、數個共識重複序列、一個類表皮生長因子區域，以及一個終端凝集素區域，後者主要負責結合糖基化蛋白質或脂質上的碳水化合物組。然而，類表皮生長因子區域也參與選擇素-配體識別[29, 48]。血管內皮上發現的選擇素有E型選擇素和P型選擇素，它們都參與白血球-內皮細胞相互作用[108]。P型選擇素原先就存在，隨後儲存在內皮細胞的Weibel–Palade體中。血栓素和組織胺等刺激誘導的Weibel–Palade體外泌使P型選擇素快速轉移到細胞表面[19, 53]。然而，由於P型選擇素的內吞作用和重新導向到溶酶體顆粒或高爾基體，這種表達是短暫的，在新形成的Weibel–Palade體中恢復[109]。E型選擇素不儲存在顆粒中，而需要新的mRNA和蛋白質合成才能表達在細胞表面。白細胞素-1、腫瘤壞死因子α和內毒素的刺激會增加E型選擇素的表達；這通常需要2-6小時[47]。在某些組織如皮膚中，P型和E型選擇素似乎是內皮細胞上的常態表達[78, 139]。

整合素是由非共價鍵結合的α和β亞基組成的異二聚體分子。兩個亞基都有細胞質尾部和跨膜區域，共同構成一個整體膜蛋白。迄今為止，已經發現了18種不同的α亞基和8種β亞基，這意味著每種整合素都以其亞基的特定組合為特徵[142]。許多細胞類型，包括內皮細胞、白血球和血小板上都有整合素。內皮細胞在其腔內膜上表達整合素αVβ3，這是血小板-內皮細胞相互作用的重要媒介[11]。大多數其他內皮細胞整合素參與與基底膜的結合。這些整合素，如α2β1、α5β1和α6β1，與多種細胞外基質配體結合，因此，負責與層粘連蛋白、纖維連接蛋白和膠原蛋白的相互作用。許多研究已經並仍在關注這些整合素與血管新生期間的次內皮基質相互作用[98]。

免疫球蛋白超家族的糖蛋白以細胞質尾部、跨膜區域和多個向腔內突出的類免疫球蛋白區域為特徵。最著名的例子是細胞間黏附分子1和2（ICAM-1和-2）、血管細胞黏附分子1（VCAM-1）和血小板/內皮細胞黏附分子1（PECAM-1），它們作為白血球和血小板上整合素的配體，是白血球定位到內皮細胞和隨後的穿越作用的關鍵媒介。ICAM-1和-2以及PECAM-1具有基線表達，而VCAM-1則在內皮細胞受到細胞因子刺激後才出現，這也會提高ICAM-1的表達[71]。矛盾的是，經過細胞因子處理後，PECAM-1的構成表達會減少[113]。ICAM-2在炎症中的作用仍不清楚，因為它也會被炎症刺激物下調。最近的研究顯示，ICAM-2參與血管新生的調節[41]。

除了細胞黏附分子外，內皮細胞糖萼還擁有在凝血、纖溶和止血中具有功能的糖蛋白。一個很好的例子是血小板Ib-IX–V複合體，它在內皮細胞和血小板上均有表達。它由四種糖蛋白組成：Ibα、Ibβ、IX和V，每個都是穿膜多肽。糖蛋白Ibα和Ibβ通過二硫鍵共價鍵結，而IX和V則非共價鍵結到Ib異二聚體上。Ib-IX–V複合體與馮·威爾布蘭德因子（vWf）結合，主要被認為是血小板vWf受體[65, 99]。此外，該複合體還與P型選擇素結合，介導血小板與活化內皮細胞之間的相互作用[7]。與血小板一樣，內皮細胞也表達Ib-IX–V複合體的所有組成部分[115, 141]，一方面允許其與次內皮層的vWf底物結合，另一方面與由活化內皮細胞向腔內分泌的Weibel–Palade體衍生的vWf結合。

在蛋白聚糖和糖蛋白的網絡內以及其上層中嵌入了各種類型的可溶性成分，如蛋白質和可溶性蛋白聚糖。這些成分要么來自內皮細胞，要么來自血流，如白蛋白和歐洲黏液蛋白，它們在維持滲透性屏障的（電荷）選擇性中起著關鍵作用[42]。糖萼的可溶性成分極大地促進了糖萼的功能重要性，將在下文中描述。這些可溶性成分的結構屬性尚未完全確立。至少部分可溶性成分可能有助於腔內糖萼的結構組織，儘管這一點難以證明。有跡象表明，蛋白聚糖相互結合並與蛋白質結合[54, 88]。已經確定了蛋白質-糖胺聚糖-蛋白質複合物的存在，儘管不是特別在糖萼中[145]。然而，可以假定膜結合的蛋白聚糖、可溶性蛋白和可溶性蛋白聚糖之間的相互作用形成了交聯網絡，為腔內糖萼提供了一定的穩定性。透明質酸在這方面可能發揮重要作用，它是一個非常大的直線分子，可能未與內皮細胞膜結合（圖1）。已經證明它能與自身互動，形成穩定的透明質酸-透明質酸複合物[103, 104]。然而，糖萼是一層脆弱的層，移除一個特定成分可能導致整體功能的喪失[117]。

功能重要性

位於血流和內皮之間的內皮細胞糖萼是血管通透性的重要決定因素[35, 130]。它能夠限制某些分子到達內皮細胞膜，這已在使用各種分子量的熒光染料代黴素的小鼠腸系膜動脈中得到證明，顯示較小分子的通透性增加[125]。內皮細胞糖萼在大鼠心肌毛細血管中被酶部分移除後，其通透性屏障功能的隨後喪失導致心肌水腫[124]。在糖萼依賴的通透性中，不僅大小和空間阻礙發揮作用，糖萼和滲透物質的電荷也發揮作用。由於許多糖胺聚糖鏈高度硫化，糖萼呈現出一個對血流具有網狀負電荷的表面。因此，糖萼的中和誘導培養內皮細胞對白蛋白的攝取增加[121]，並增加了大鼠腸系膜動脈對熒光標記代黴素的通透性[126]。

用於描述微血管液體交換的經典模型是Starling模型[112]，該模型指出毛細血管內皮的液體過濾率由血管腔和周圍組織中的水力壓和膠體滲透壓決定。這一平衡被應用於整個橫跨內皮屏障，不同壓力被整體評估。相對較厚的內皮細胞糖萼的發現及其對水腫形成等的影響，導致Weinbaum[137]和Michel[68]對Starling原理進行了重大修訂，他們建議將壓力梯度僅應用於內皮細胞糖萼。Hu和Weinbaum使用這一理念生成了一個3D模型，用於描述內皮層不同區域的通透性，如糖萼、內皮裂隙和緊密連接[40]。最近，這一模型被簡化為1D描述，說明了不同組織濃度梯度的變化和隨之而來的內皮通透性[144]。另一種模型，稱為糖萼-連接-斷裂模型，將Starling機制應用於糖萼，並基於內皮中理論上的“孔隙”描述了其對溶質和水通過內皮的運輸效應[79]。最近，Curry就這一模型以及表型變化對微血管通透性的影響撰寫了一篇綜述[14]。Rehm等人[91]和Jacob等人[45]的研究也強調了內皮細胞糖萼在控制膠體和液體滲出方面的重要性，他們在隔離的灌注心臟模型中展示了糖萼降解後內皮屏障功能受損。5%白蛋白或6%羥乙基澱粉（一種天然和人工膠體）的灌注導致液體滲出減少。然而，在溫熱缺血20分鐘後，僅白蛋白灌注防止了血管漏。這凸顯了完整糖萼的重要性，以及血漿衍生蛋白質在糖萼有效功能中的作用。修訂後的Starling原理提供了更詳細的血管通透性洞察，並強調內皮細胞糖萼作為主要決定因素的重要性。

除了其限制分子到達內皮的能力外，糖萼還影響血細胞-血管壁相互作用。它使紅血球遠離內皮。在微循環中，體內可以觀察到一個圍繞內皮的紅血球排斥區，該區在輕染料引起的糖萼降解後減少[129]。同樣，在控制條件下，血小板與內皮的相互作用並不常見，而部分糖萼被氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）灌注去除後，伴隨著血小板-血管壁相互作用的增加[128]。糖萼在白血球-血管壁相互作用中的作用似乎是雙重的：一方面，它擁有內皮細胞黏附分子，如P型選擇素、ICAM-1和VCAM-1；另一方面，它減弱了白血球對這些分子的黏附。

在健康小鼠股薄肉肌靜脈中，通過肝素酶降解肝素硫酸鹽側鏈會導致白血球以劑量依賴的方式增加對內皮的黏附[13]。氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）或TNFα的給藥也會誘發白血球滾動和黏附[13, 36]。空間阻礙似乎在這個過程中起作用。內皮細胞糖萼的厚度（毛細血管中為0.2-0.5微米[124]，小動脈中為2-3微米[125]，頸動脈中為4.5微米[67]）比各種細胞黏附分子的長度要厚得多。例如，引發白血球滾動的P型選擇素，僅從內皮表面向外延伸約38納米[111]。在轉染有兩至六個共識重複序列的P型選擇素構建的培養細胞上，隨著P型選擇素長度的減少，黏附的中性粒細胞數量隨之減少。缺乏糖基化的細胞，擁有較薄的糖萼，顯示出中性粒細胞黏附增加[81]。因此，在正常條件下，糖萼的糖胺聚糖鏈和可溶性成分似乎遮蔽了黏附分子，從而防止了相互作用。降解糖萼或引起更開放網絡的刺激，如酶、細胞因子或缺血和再灌注，似乎揭露了黏附分子，進而允許血細胞與內皮相互作用[13, 36, 70, 128]。應該意識到，白血球的內皮細胞黏附分子配體不是均勻分佈在白血球的細胞膜上，而是與微絨毛和膜皺襞有關[102]。由於估計糖萼的剛度較低[33, 106, 138]，帶有配體的白血球膜突起很可能相對容易穿透糖萼以到達其受體，從而實現白血球-血管壁相互作用。與其他組織不同，即使在沒有先前創傷或炎症的正常情況下，靜脈中的白血球-血管壁相互作用也會在皮膚中自發發生[46, 78]。這是否與皮膚微血管中糖萼結構和/或組成的偏離有關，尚待闡明。

體內相對較厚的內皮細胞糖萼的存在對流變學，特別是在微血管中，具有重大影響[62, 84]。在這部分循環中，局部血液黏度和血液比容似乎受到糖萼的調節。Pries和Secomb最近利用一個基於血液動力學和體內微血管網絡血液比容測量的物理模型，展示了在重建的腸系膜微血管網絡中加入對糖萼尺寸的現實估計會導致血液表觀黏度大約增加兩倍。這些變化足以最小化先前研究中實驗確定的和理論預測的微血管網絡阻力之間的差異，這些研究是基於沒有糖萼的玻璃毛細管中的血液表觀黏度[85]。

內皮細胞暴露於血流引起的機械力中。長期以來，人們已經認識到這些力量，特別是剪切應力，決定了內皮細胞的形態和功能[16, 18]。暴露於剪切應力的內皮細胞會產生一氧化氮（NO）[96]，這是血管張力的重要決定因素。然而，負責將生物力學力轉化為生化信號（機械傳導）的分子尚未被確定。最近，糖萼被加入到可能的候選者名單中。Florian及同事在培養內皮細胞的研究中[24]表明，使用肝素酶特異性降解肝素硫酸鹽糖胺聚糖會導致對剪切變化的反應不足和一氧化氮產生受損。同樣，Mochizuki及同事在犬股動脈的體外實驗中也發現，使用透明質酸酶灌注後，降解了糖萼中的透明質酸糖胺聚糖，導致剪切誘導的一氧化氮產生減少[69]。因此，肝素硫酸鹽和透明質酸似乎都在檢測和放大流動誘導的剪切力中發揮作用[69]。

有趣的是，發現人臍靜脈內皮細胞暴露於剪切應力下會使糖萼中透明質酸的量大約增加一倍，這可能代表內皮細胞對剪切應力感知的正反饋[30]。另一項近期研究顯示了剪切應力剖面與小鼠頸動脈糖萼尺寸之間的相關性；發現共同頸動脈的層流剖面與399±174納米的糖萼厚度一致，而頸動脈分叉竇區域的紊流層流則與較薄的糖萼73±36納米一致[123]。此外，頸動脈分叉的流動分隔區域，據推測有未受干擾的高層流剖面，被308±185納米的糖萼覆蓋，與共同頸動脈的糖萼厚度相當。

從這些數據來看，糖萼在機械傳導中似乎扮演著重要的角色，且其組成反過來（至少部分地）是剪切依賴的。糖萼的不同組成部分可能共同作用，這意味著整個糖萼負責其作為機械傳導器的角色。這一想法得到了基於內皮細胞膜上核心蛋白定期六角形分佈的理論模型的證實[138]。最近，Tarbell和Pahakis回顧了目前有關(膜結合的)糖萼的機械傳導概念[116]。他們得出結論，糖萼核心蛋白負責將剪切應力信號傳遞到特定的細胞信號過程中，例如一氧化氮的產生和細胞骨架的重組。同時，剪切應力也傳遞到內皮細胞的其他區域，如細胞間連接和基底黏附斑塊，即使在沒有糖萼的情況下，這些區域也負責額外的剪切感應。

糖萼中的蛋白聚糖極大地促進了其功能重要性。由於鏈的表旋轉、延長，尤其是鏈的硫化，產生了多樣的糖胺聚糖鏈，形成了一個異質表面，許多血漿衍生分子可以在此停泊。表3列出了一些依賴於與糖萼的互動來實現其功能的分子。

表3

依賴於與內皮細胞糖萼互動以正常功能的分子

血漿衍生分子的停泊可以通過幾種方式影響局部環境：(1) 受體或酶及其配體與內皮細胞糖萼的結合導致這些物質的局部濃度升高，從而實現適當的信號傳導或酶促修飾。成纖維細胞生長因子（FGF）信號傳導就是以這種方式進行的，並且已知完全依賴於配體和受體與糖萼的相互作用[3, 26]。同樣，糖萼參與脂解系統，結合脂蛋白脂酶和其配體低密度脂蛋白（LDL）[133, 140]。(2) 血漿衍生分子與糖萼的結合可以導致局部濃度梯度，這經常見於生長因子調控的基因轉錄和發育過程中[61, 82]。(3) 酶及其促進劑或抑制劑與糖萼的結合增加了糖萼功能的血管保護作用。幾個重要的抗凝血介質可以結合到糖萼，如抗凝血酶III、肝素輔因子II、血栓調節蛋白和組織因子途徑抑制劑（TFPI）。抗凝血酶III是一種強大的凝血酶和活化的X因子和IX因子（FXa和FIXa）的抑制劑[87]。已知它與肝素硫酸鹽的特定區域結合，從而增強其抗凝血活性[107]。肝素輔因子II是一種特異性凝血酶抑制劑[80]，它通過糖萼中的硫酸皮膚素激活[120]。血栓調節蛋白是內皮細胞表達的含硫酸軟骨素蛋白，能將凝血酶從凝血酶轉化為蛋白C途徑的激活劑，從而變成抗凝血[136]。TFPI是FVIIa和FXa的強效抑制劑。據信TFPI通過肝素硫酸鹽與糖萼結合，但也可能涉及其他蛋白質[49]。此外，TFPI-FXa複合物的攝取和降解依賴於糖萼中的肝素硫酸鹽[38]。所有這些存在於糖萼中的抗凝血分子有助於健康內皮的抗血栓性質[21]。內皮細胞糖萼還通過結合細胞因子和減弱細胞因子與細胞表面受體的結合來調節炎症反應。糖萼中肝素硫酸鹽的剝離導致內皮細胞對細胞因子的激活敏感性增加[9, 10]。內皮細胞糖萼的血管保護作用的另一個方面是其結合氧自由基清除劑的能力，如細胞外超氧化物歧化酶（SOD）[59]。這些酶有助於減少氧化應激並維持一氧化氮的生物利用性，從而防止內皮細胞功能失常。

在健康的血管中，內皮細胞糖萼決定血管通透性，減弱血細胞-血管壁相互作用，介導剪切應力感知，實現平衡的信號傳遞，並發揮血管保護作用。但當它受到破壞或改變時，這些性質會丟失，正如實驗環境中直接針對糖萼所顯示的那樣。在過去的幾年中，證據顯示糖萼（損傷）在幾種血管病理中發揮著關鍵作用。這裡，我們將討論其在糖尿病、缺血/再灌注和動脈粥樣硬化中的懷疑角色。

糖尿病 糖尿病是一種臨床上眾所周知的疾病，具有深遠的併發症，如視網膜病和腎病，並增加動脈粥樣硬化心血管事件的風險。糖尿病的一個特點是胰島素缺乏或抵抗和隨後的高血糖，損害了血管壁的保護能力[73]，導致增強的內皮通透性[1]和一氧化氮合酶功能受損[20]。然而，尚未確定通往這些血管功能障礙的共同途徑。最近的研究顯示，健康志願者的全身糖萼體積，在用糖萼可滲透和不可滲透追蹤劑比較血管內分佈體積後，發現在誘導急性高血糖後6小時內減少了一半[76]。使用相同的方法，發現1型糖尿病患者的全身糖萼體積大約是健康對照組的一半；在有微量白蛋白尿的糖尿病患者中進一步減少[75]。在同一研究中，發現糖尿病患者的透明質酸和透明質酸酶血漿水平升高，反映了在高血糖條件下透明質酸合成和剝離的增加。兩項研究均顯示，急性和長期高血糖與糖萼尺寸的顯著減少相關。可以推測，這種對糖萼的損害有助於高血糖條件下的內皮功能障礙，這在非糖尿病受試者中也可以測量[118]。需要進一步研究來調查糖萼的擾動是否對糖尿病的（微）血管併發症負責。

缺血/再灌注 在缺乏或降低血流（全面或部分缺血）期間對組織的損害，可能會被恢復血流（再灌注）所加劇，這似乎矛盾。儘管由缺血/再灌注引起的損害程度因組織而異，但對所有器官來說，這一病理過程的共同組成部分是微血管功能障礙[32, 105]。內皮細胞發揮中心作用，在缺血/再灌注後表現出腫脹和與基底膜的分離[77]。特別是在毛細後靜脈中，內皮細胞受到增加的氧化應激[56]，白血球黏附和穿越[8, 132]，血管通透性增加[55]。這些缺血/再灌注對內皮的影響暗示了內皮細胞糖萼的參與。的確，最近Mulivor和Lipowsky[70]展示了腸道缺血/再灌注導致大鼠腸系膜靜脈的糖萼厚度顯著減少，這很可能是由於糖胺聚糖鏈的剝離。缺血/再灌注對糖萼的影響可以通過阻斷黃嘌呤氧化還原酶（一種結合於糖萼中的肝素硫酸鹽領域的內源性活性氧（ROS）生成酶）來減輕。這樣確立了ROS在缺血/再灌注中糖萼的破壞和剝離中的中心作用[97]。輸注外源性透明質酸以恢復糖萼或施用百日咳毒素（抑制G蛋白介導的糖胺聚糖鏈剝離）也減少了缺血/再灌注引起的損害[70]。綜合這些數據表明，內皮細胞糖萼在缺血/再灌注引起的組織損傷的病理生理學中發揮著作用。然而，其在這一過程中的相對貢獻以及可能的治療干預的影響尚待確定[6, 122, 134]。

動脈粥樣硬化 动脉粥样硬化是一种大动脉疾病，通常需要高浓度的低密度脂蛋白（LDL）在易患部位发展[34]，这些部位以紊流剖面为特征。动脉粥样硬化脂蛋白的次内皮滞留和随后的炎症反应导致次内皮斑块的形成[60, 93]。內皮細胞糖萼在动脉粥样硬化发生中的作用尚未明确，但有一些有趣的观察表明其可能参与其中。
2000年，Vink等人[128]展示了临床相关剂量的氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）导致仓鼠股薄肉肌微循环中糖萼的破坏，并引发局部血小板黏附。联合使用超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶，这些酶催化超氧阴离子的歧化和过氧化氢的分解，消除了ox-LDL的影响，这暗示了氧衍生自由基的作用。的确，糖萼的丢失导致内源性保护酶（如细胞外SOD）的脱落，并增加了内皮细胞的氧化应激。这一点在van den Berg等人[123]最近的研究中得到了进一步说明，该研究显示由于高脂肪、高胆固醇饮食导致糖萼尺寸减少。此外，发现糖萼厚度和内膜-中膜比率之间存在反向关系，反映了在动脉粥样硬化风险较高的部位，内皮細胞糖萼的血管保护能力减少。在健康小鼠中，发现区域差异表明，与共同颈动脉相比，颈动脉窦区域的糖萼较薄。综合这些数据表明，內皮細胞糖萼参与动脉粥样硬化过程的启动和进展[74]。

总之，內皮細胞糖萼在几种血管疾病中似乎受到干扰。目前尚未明确糖萼干扰是否在这些疾病的病理生理学中起因果作用。如果是这样，恢复糖萼可能是一个有趣的治疗目标。此外，识别这些疾病中涉及的特定糖胺聚糖域，作为其他物质或信号通路的平台，也可能证明具有治疗价值[4]。

可視化技術

由於內皮細胞糖萼的功能重要性，開發直接可視化技術對於確定其確切作用至關重要。通過給予特定標記物來標記糖萼，這些標記物能夠附著在其一個或多個組成部分上，使其發光或可檢測。然後，對（部分）血管進行制備將允許對內皮細胞糖萼進行特定的顯微成像。遺憾的是，糖萼非常脆弱，在血管處理和制備過程中容易受到干擾或脫水。因此，糖萼尺寸很容易被低估，這一點從1966年使用探針銣紅進行的首次透射電子顯微鏡（TEM）糖萼圖像中可以看出；這種方式測量的毛細血管糖萼厚度約為20納米[66]。從那時起，進行了許多其他嘗試使用TEM成像糖萼。在3.0帕剪切應力條件下的牛主動脈內皮細胞上，報導糖萼厚度為40納米[121]。這些尺寸與理論預測的糖萼厚度高達1微米不符[51]。使用新的Alcian藍8GX染色方案，van den Berg等人[124]最近應用TEM測量大鼠心肌毛細血管中內皮細胞糖萼的尺寸，發現內皮細胞被200-500納米厚的糖萼覆蓋（圖2a）。在固定和染色之前進行透明質酸酶處理導致這層顯著減少至100-200納米。Haraldsson[37]和Rostgaard和Qvortrup[94, 95]的研究小組改進了TEM染色方案，使用氟碳基氧攜帶固定劑，顯示腎小球毛細血管的糖萼厚度為60-200納米，腸道有窗的毛細血管為50-100納米。顯然，新的染色和制備方案改進了TEM實驗中的糖萼保護。然而，TEM不能在體內情況下使用。

圖2

使用不同顯微技術可視化內皮細胞糖萼。a 大鼠左心室心肌毛細血管的內皮細胞糖萼，用Alcian藍8GX染色並通過電子顯微鏡顯示。條形代表1微米。轉載自參考文獻編號[124]。b 仓鼠股薄肉肌毛細血管的內皮細胞糖萼的活體內顯微錄像。5.4微米的解剖直徑大於紅血球柱寬度（左側圖）或用熒光代黴素（70 kD）標記的血漿柱寬度（右側圖）。這種差異是由內皮細胞糖萼的存在造成的。左側圖中的條形代表5微米。轉載自參考文獻編號[129]。c 小鼠共同頸動脈的內皮細胞糖萼。使用雙光子激光掃描顯微鏡獲得的一系列光學切片的3D重建，顯示部分血管壁。完整的血管用FITC標記的凝集素（WGA）灌注以染色內皮細胞糖萼（綠色）和SYTO 41標記細胞核（藍色）。箭頭指示X、Y和Z軸的方向。掃描的體積約為200×200×60微米^3。有關方法的詳細信息也可參考文獻編號[67]。

在首次TEM圖像製作大約30年後，Vink等人[129]使用活體內顯微鏡術，通過間接方法在體內觀察仓鼠股薄肉肌毛細血管中的內皮細胞糖萼。糖萼被識別為紅血球的“排斥區域”或“間隙”，位於流動的紅血球和內皮之間。此外，通過熒光代黴素標記了血漿，糖萼則顯現為血漿排斥區域（圖2b）。有趣的是，對於滾動的白血球並未發現排斥區域，這表明它們能夠壓縮這些血管中的糖萼，這與糖萼估計的低剛度相符[33, 106, 138]。從解剖內徑減去血漿柱直徑可以揭示糖萼的尺寸，其厚度似乎為0.4-0.5微米[129]。此方法此後已在許多研究中使用，主要是在仓鼠[35, 36, 130]或小鼠[13, 97]的股薄肉肌微循環中。這種組織適合進行活體內顯微鏡觀察，因為它薄而透明，能清晰顯示微血管內皮細胞和流動的血細胞，且血管壁運動輕微或不存在（圖2b）。此外，還可以測量局部流速。然而，使用基於活體內顯微鏡的方法估計糖萼厚度是間接的。此外，活體內顯微鏡無法應用於在較大血管中成像內皮細胞糖萼。

糖萼的直接可視化已通過幾種方法進行，主要使用凝集素，這些是與糖胺聚糖鏈的特定雙糖基團結合的蛋白質[5, 24, 70]。其他標記包括肝素硫酸鹽、syndecan-1或透明質酸的抗體[24, 70]。將這些標記物附著到熒光探針上，可以應用先進的顯微技術來可視化糖萼。共軛焦激光掃描顯微鏡（CLSM）能夠進行光學切片，具有良好的光學解析度，允許對樣品進行3D重建。對人臍靜脈內皮細胞培養的糖萼進行凝集素標記，隨後進行CLSM成像，揭示了一層厚達2.5±0.5微米的表面層[5]。CLSM還用於檢測缺血/再灌注和炎症情況下大鼠腸系膜毛細後靜脈固定的糖萼中熒光標記凝集素的濃度變化[70]。由於較大血管的壁更厚，導致較低的光穿透深度，且在較高深度（>40微米）由於信號散射增加而導致顯著的解析度損失[127]，因此CLSM不太適合在動脈中成像糖萼。

一種在體外和體內直接可視化大型血管中糖萼的有前途技術是雙光子激光掃描顯微鏡（TPLSM）。TPLSM依賴於熒光團的激發，通過同時吸收（即在10^-18秒內）兩個紅色光子，而不是像常規熒光激發中的一個藍色光子。使用長波長紅色光子減少了散射，從而增加了組織穿透深度。熒光團的激發和隨之而來的熒光只發生在照明錐的焦點處，因為兩光子激發的概率取決於激發光子強度的平方。任何由光電倍增管接收的光必須來自焦點位置，因此發射光子的散射不影響解析度，也不需要孔隙。因此，TPLSM提供良好的解析度和光學切片，且合理的獲取速度，同時減少了染料的漂白和光毒性，限制在焦點位置。增強的穿透深度、良好的解析度、光學切片和低光毒性的結合使TPLSM成為可視化大型血管中微妙的內皮細胞糖萼的合適技術。這一想法被Megens及同事[67]的近期研究證實，在這項研究中，使用TPLSM在完整的小鼠頸動脈中成像糖萼（圖2c）；發現糖萼厚度為4.5±1.0微米。由於TPLSM也適用於體內的啮齒動物[127]，它可能證明是這些動物的大循環中糖萼體內可視化的好方法。

結論

覆蓋在血管內皮上的糖萼是一種膜綁定的網絡，血漿衍生分子在其中整合。它在正常血管生理學中以及血管疾病中執行多種功能。儘管微循環的實驗數據，以及最近的大循環研究強烈暗示糖萼對於血管具有保護作用，但由於缺乏良好的可視化技術，這方面的研究受到了阻礙。雙光子激光掃描顯微鏡可能證明是一種成功的工具，用於實現體外和體內啮齒動物較大動脈中糖萼的直接可視化，並有可能分析這層的組成或完整性的局部變化。

參考文獻