D-二聚體檢測在犬隻播散性血管內凝血診斷中的臨床應用

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播散性血管內凝血（DIC）是一種由其他疾病引發的二次病症，對犬隻健康威脅重大。研究顯示，測量血漿D-二聚體（DD）濃度可作為DIC診斷的重要指標。通過對205隻犬的DD測量，結果顯示DIC組的DD濃度顯著高於其他組，且DD與纖維蛋白降解產物（FDPs）濃度相關，為DIC診斷提供了有力支持。建議將DD和FDPs測量結合使用，提高診斷準確性。

Clinical use of D-dimer measurement for the diagnosis of disseminated intravascular coagulation in dogs

D-二聚體測量在犬隻播散性血管內凝血診斷中的臨床應用

Machida T, Kokubu H, Matsuda K, Miyoshi K, Uchida E. Clinical use of D-dimer measurement for the diagnosis of disseminated intravascular coagulation in dogs. J Vet Med Sci. 2010;72(10):1301-1306. doi:10.1292/jvms.09-0523

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20467203/

Abstract

We measured the plasma D-dimer (DD) concentration in 205 dogs. Simultaneously, fibrinogen/fibrin degradation products (FDPs) concentration, platelet (PLT) count, prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (APTT), and plasma concentrations of fibrinogen (Fib) were measured in the same dogs. From these results, we were able to divide the animals into four groups: control (healthy dogs, n=18), pre-disseminated intravascular coagulation (preDIC) (n=20), disseminated intravascular coagulation (DIC) (n=21), and other (n=146). Significant differences in plasma DD concentration were found among the four groups: control, 0.45 ± 0.46 µg/ml (reference range, 0-1.37); preDIC, 5.0 ± 4.8 µg/ml; DIC, 16.3 ± 12.2 µg/ml; and other, 1.5 ± 2.7 µg/ml. A weak positive correlation (r=0.62) was found between FDPs and DD concentrations in the DIC group. As a DIC diagnostic test, the PLT/APTT/FDPs/DD combination had the highest accuracy of 100%, with a sensitivity of 73% and a specificity of 97%. We propose the use of FDPs and DD concentrations as part of the DIC diagnostic test panel, with DD and FDPs to provide accurate diagnosis.

摘要

我們測量了205隻犬隻的血漿D-二聚體（DD）濃度。與此同時，測量了同一批犬隻的纖維蛋白原/纖維蛋白降解產物（FDPs）濃度、血小板（PLT）計數、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血酶時間（APTT）以及血漿纖維蛋白原（Fib）濃度。根據這些結果，我們將動物分為四組：對照組（健康犬，n=18）、播散性血管內凝血前期（preDIC，n=20）、播散性血管內凝血（DIC，n=21）和其他組（n=146）。在這四組中，血漿DD濃度顯示顯著差異：對照組為0.45 ± 0.46 µg/ml（參考範圍，0-1.37）；preDIC為5.0 ± 4.8 µg/ml；DIC為16.3 ± 12.2 µg/ml；其他組為1.5 ± 2.7 µg/ml。在DIC組中，FDPs和DD濃度之間發現弱正相關（r=0.62）。作為DIC診斷測試，PLT/APTT/FDPs/DD的組合具有最高的準確性（100%），靈敏度為73%，特異性為97%。我們提議將FDPs和DD濃度作為DIC診斷測試面板的一部分，通過DD和FDPs提供準確的診斷。

**播散性血管內凝血（DIC）**是一種次級疾病，通常由潛在的原發性病理過程引發[2, 5, 10, 17]。此外，DIC患者的狀況會隨時間變化，因此實驗室凝血測試的結果可能會迅速且反覆波動。大多數獸醫對診斷DIC的合理實驗室方法並不十分了解。他們會訂購大量的測試，但其中大部分並不具有特異性，並且透過重複進行相同的測試來追蹤病情的變化。DIC診斷中，D-二聚體（DD）被發現是有用的標誌物。乳膠凝集DD和血清及血漿FDPs的測定具有相似的靈敏度和特異性；免疫濁度法在0.30 µg/ml的臨界值下特異性較低（77%），而在0.39 µg/ml的臨界值下靈敏度較低（65%）[16]。研究顯示，根據測量DD濃度的方法不同，評估結果有所差異。此外，DD濃度會根據使用的測量試劑盒而有所不同。

在不同國家的犬隻中，已有許多關於DD濃度測量的報告[3, 9, 13–16]。然而，在日本進行此類研究的數量較少。因此，本研究的目的是檢驗在日本可使用的試劑中，DD濃度測量對DIC犬隻的實用性。

在人類DIC患者的治療中，纖維蛋白原/纖維蛋白降解產物（FDPs）和D-二聚體（DD）的結合已被報導為最佳分子標誌物，用於理解DIC中凝血和次級纖溶系統的系統性激活過程[6, 12–14]。DD是純粹的交聯纖維蛋白降解產物。因此，DD濃度的增加特異於凝血與纖溶（無論是生理性還是病理性）的同時存在。相反，FDPs濃度的增加並不特異於活躍的凝血，因為FDPs包含了纖維蛋白和纖維蛋白原的降解產物。然而，當FDPs濃度增加時，則顯示活躍的纖溶作用[1, 2, 5, 7]。

報告指出，使用抗人類DD小鼠單克隆抗體的免疫濁度測定（TIA）和乳膠凝集法被用於犬隻中DD濃度的測量[3, 9, 13–16]。在這些研究中，DD測量顯示出不同的結果。

材料與方法

研究對象為205隻犬隻，這些犬隻來自Rakuno Gakuen大學獸醫教學醫院。這205隻犬隻包括34種犬種，其中114隻為雄性（22隻已去勢），91隻為雌性（26隻已絕育）。

血液樣本從頸靜脈、頭靜脈或大隱靜脈收集。血液樣本按照以下順序獲取：1）1毫升收集於含有乙二胺四乙酸（EDTA）的管中；2）1毫升收集於含有3.8%檸檬酸鈉的管中；3）1毫升收集於含有凝血酶、阿普斯坦和蛇毒的真空管中。樣本（不包括EDTA管中的樣本）經離心（2,000 rpm，15-25°C，10分鐘），並在收集後30分鐘內完成。血小板（PLT）計數、凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血酶時間（APTT）和血漿纖維蛋白原（Fib）、FDPs和DD濃度的測量在樣本準備後2小時內完成。

PLT計數使用自動血球計數儀（MICROS abc LC-152 Horiba，日本京都）進行測定。PT、APTT和血漿Fib濃度使用半自動機械凝血檢測系統（DRIHEMATO®系統CG 02V，A&T，日本神奈川）進行測量。FDPs和DD濃度使用BECKMAN-COULTER SYNCHRON Clinical System CX® 7Δ（Beckman-Coulter，加州Brea，美國）進行測定。血清FDPs濃度的測量使用抗人類Fib兔多克隆抗體，血漿DD濃度的測量使用抗人類DD小鼠單克隆抗體，兩者均使用乳膠凝集測定法。

選取三個來自犬隻的血漿樣本，這些樣本具有不同範圍的DD濃度（18.72、9.42和3.05 µg/ml），並使用標準稀釋溶液進行稀釋，分別測定每個稀釋樣本的濃度，並進行三次重複測量。

DIC的診斷基於以下四項或更多異常結果：低PLT計數（<200 × 10³/µl）、延長的PT（>8.0秒）或APTT（>18.0秒）、低Fib濃度（<150 mg/dl）或高FDPs濃度（≥10 µg/ml）以及有碎裂紅血球的存在。PreDIC的診斷基於上述三項結果[4, 5, 7]。

我們將205隻來自Rakuno Gakuen大學獸醫教學醫院的犬隻分為四組：對照組（n=18；9隻雄性和9隻雌性；年齡1–8歲；體重3–30 kg）、preDIC組（n=20；9隻雄性和11隻雌性；年齡1–13歲；體重3–30 kg）、DIC組（n=21；14隻雄性和7隻雌性；年齡5–13歲；體重3–30 kg）和其他組（n=146；75隻雄性和71隻雌性；年齡1–15歲；體重3–30 kg）。對照組包括臨床健康、凝血因子測量正常的犬隻，其他組包括所有臨床不健康且不符合對照組、DIC組或preDIC組的犬隻。我們比較了四組之間的凝血因子。

數據的正態分佈通過卡方檢定（²）進行評估，並通過Mann-Whitney檢定分析各組之間的差異。P值<0.05被認為具有顯著性。我們使用線性判別函數（變量選擇）來確定在判別分析中對照組與DIC組之間差異最大的57種組合模式。進行了受試者工作特徵（ROC）分析，以評估DD和FDPs測量的可靠性。可靠性以ROC曲線下面積（AUC）表示，評估值設定為最大1，最小0.5。當AUC值超過0.8時，表示可靠性高，並視為優異[8, 11]。

結果

如圖1所示，對三個血漿樣本進行稀釋線性檢測的分析結果顯示，線性回歸方程的相關係數均高於0.99。

表1顯示各組之間的凝血測試結果存在顯著差異。圖2顯示FDPs和DD濃度在各組之間存在顯著差異。在對照組中，血清FDPs濃度為0.46 ± 0.72 µg/ml（參考範圍，0–1.90 µg/ml），血漿DD濃度為0.45 ± 0.46 µg/ml（參考範圍，0–1.37 µg/ml）。在preDIC、DIC和其他組中，FDPs濃度分別為10.0 ± 5.7、18.6 ± 8.0和3.2 ± 4.5 µg/ml；DD濃度分別為5.0 ± 4.8、16.3 ± 12.2和1.5 ± 2.7 µg/ml。FDPs和DD濃度在preDIC和DIC組中顯著高於對照組和其他組，且DIC組的平均FDPs和DD濃度顯著高於preDIC組（圖2）。PLT計數、PT和APTT在preDIC和DIC組與對照組及其他組之間有顯著差異（表1）。

圖1. D-二聚體濃度的稀釋線性 來自犬隻的三個血漿樣本，這些樣本具有不同範圍的DD濃度，分別使用標準稀釋溶液進行稀釋，並對每個稀釋樣本的濃度進行三次重複測定。

• 18.72 µg/ml，y = 4.745x + 0.031，r = 0.9989。
• 9.42 µg/ml，y = 2.394x + 0.029，r = 0.9954。
• 3.05 µg/ml，y = 0.764x + 0.045，r = 0.9945。

表1. 對照組、preDIC組、DIC組和其他組的凝血測試參考範圍、均值和標準差值 圖2. 對照組、preDIC組、DIC組和其他組的血漿DD和血清FDPs濃度分佈

A、血漿DD濃度；
B、血清FDPs濃度。
其他組包括所有臨床不健康的犬隻，但不包括對照組、DIC組或preDIC組。
對照組，n=18；preDIC組，n=20；DIC組，n=21；其他組，n=146。

• P<0.05，** P<0.01。

在205個樣本（包括健康犬隻和患有各種疾病的犬隻）中，FDPs與DD濃度之間的相關性很高（y = 0.99x + 2.25，r = 0.79，n = 205）（圖3）。然而，當調查DIC組中FDPs與DD濃度的相關性時，僅發現弱正相關（y = 0.47x + 11.9，r = 0.62，n = 21）（圖4）

FDPs和DD濃度的ROC曲線（對照組，n = 18；DIC組，n = 21）見圖5。FDPs的AUC（0.991）表明該值優於DD的AUC（0.938）。FDPs和DD濃度的測量在DIC診斷中的貢獻度較高，顯示出其優越性。

當我們檢查最佳組合測量順序時（即PLT計數、PT、APTT，以及血漿中的Fib、FDPs和DD濃度），發現PLT/APTT/FDPs/DD的組合優於其他56種組合（表2）。此組合的診斷準確性最高，達到100%，靈敏度為73%，特異性為97%。

討論

乳膠凝集法和免疫濁度測定法已被報導為適合測量犬隻DD濃度的方法[3, 9, 13–16]。這些檢測方法最初是為人類用途開發的，因此在本研究中，我們使用了一種可在日本使用的人類測量試劑來測定犬隻的DD濃度。看起來，這種在日本製造和使用的DD測量試劑與其他一些國家使用的試劑有所不同。

所有經過測試的稀釋液都顯示出優異的線性，這意味著自動化方法的準確性是可接受的。

圖3. 205隻犬隻中FDPs與DD濃度的相關性 圖4. DIC組中FDPs與DD濃度的相關性

對照組的平均DD濃度（± 2SD）顯示下限為0 µg/ml，上限為1.37 µg/ml（均值，0.45 µg/ml）。此處報告的健康犬隻參考濃度高於先前的報告（例如，均值為0.13、0.19或<0.25 µg/ml）[3, 14–16]。DIC組的平均DD濃度為16.3 ± 12.2 µg/ml（均值 ± 標準差）。這一濃度高於先前報告的結果（例如，均值為>0.25至0.67 µg/ml）[13–16]。這一差異的原因可能與實驗室程序有關，例如檢測方法、抗體的檢測和所使用的校準物的不同。此外，不同研究使用了不同的臨界值來確定測試的靈敏度和特異性。因此，不同系統的結果在犬隻中並不完全可比。然而，數據強烈表明，在犬隻DIC中DD濃度較高。因此，DD濃度的定量測量作為DIC的診斷指標是有用的[9, 13–16]。

DIC組的血漿DD濃度高於preDIC組。此外，四組之間的DD濃度差異具有顯著性。血清FDPs濃度也顯示出類似的結果。

在檢查所有樣本（205隻犬隻）中的血清FDPs與血漿DD濃度的相關性時，我們發現兩者之間存在強正相關。相反，在DIC組中，FDPs與DD濃度之間的相關性較弱。在DIC組的幾隻犬隻中，我們發現FDP濃度顯著升高，但DD濃度未改變（數據未顯示）。由於DIC組中的FDPs和DD濃度不一定顯示高度相關，因此它們應該分別測量。DIC是多種疾病的併發症。此外，它是一個動態現象，患者的狀況和實驗室凝血測試結果可能會顯著且反覆波動。因此，測量FDPs和DD濃度變化都是重要的。

此外，在ROC分析中，血清FDPs和血漿DD濃度在DIC診斷中的優越性得到了AUC值（分別為0.991和0.938）的證實。為了確定血漿DD濃度在區分DIC和非DIC中的診斷重要性，本研究通過分析ROC曲線確定了臨界值（1.37 µg/ml）。結果表明，該臨界值的靈敏度和特異性對臨床DIC測試是可接受的。

對照組與DIC組中各凝血測量項目的組合相關性分析顯示，最顯著的差異來自PLT/APTT/FDPs/DD的組合（準確性100%；靈敏度73%；特異性97%）（表2）。因此，包含DD濃度的測量項目組合對DIC的診斷是有效的。

綜合上述結果，使用本研究中所使用的抗人類DD小鼠單克隆抗體進行的乳膠凝集測定法是測量犬隻DD濃度的合適方法。我們建議，血漿DD濃度達1.37 µg/ml或更高將是DIC的有用診斷標準。通過乳膠凝集測定DD濃度顯示出對犬隻DIC的敏感性和特異性。至於DD濃度在患有其他系統性疾病的犬隻中的特異性，尚未確定；因此，FDPs和DD的檢測應作為輔助測試同時進行，以支持犬隻DIC的診斷。

圖5. 血漿DD和血清FDPs濃度的受試者工作特徵（ROC）曲線

A、血漿DD濃度；
B、血清FDPs濃度。
AUC表示ROC曲線下面積。

表2. DIC中凝血測試組合效用的比較

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