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鎂-L-蘆丁酸鹽有望成阿茲海默症新解方：調控腸道菌群逆轉記憶衰退

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24
2 月

本翻譯僅作學術交流用，無商業意圖，請勿轉載，如有疑議問請來信

最新研究發現，鎂-L-蘆丁酸鹽（Magnesium-L-threonate）可透過調控腸道菌群改善阿茲海默症症狀。研究顯示，此補充劑可降低腸道發炎，恢復腸道屏障功能，並影響與神經退化相關的血清代謝物，進而提升認知能力。這項發現不僅提供新的治療策略，也凸顯了腸-腦軸在神經退化疾病中的關鍵角色。

Magnesium-L-threonate treats Alzheimer’s disease by modulating the microbiota-gut-brain axis

鎂-L-蘇糖酸鹽透過調節腸道菌群-腸-腦軸來治療阿茲海默症。

Liao W, Wei J, Liu C, et al. Magnesium-L-threonate treats Alzheimer’s disease by modulating the microbiota-gut-brain axis. Neural Regen Res. 2024;19(10):2281-2289. doi:10.4103/1673-5374.391310

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38488562/

Abstract

Disturbances in the microbiota-gut-brain axis may contribute to the development of Alzheimer’s disease. Magnesium-L-threonate has recently been found to have protective effects on learning and memory in aged and Alzheimer’s disease model mice. However, the effects of magnesium-L-threonate on the gut microbiota in Alzheimer’s disease remain unknown. Previously, we reported that magnesium-L-threonate treatment improved cognition and reduced oxidative stress and inflammation in a double-transgenic line of Alzheimer’s disease model mice expressing the amyloid-β precursor protein and mutant human presenilin 1 (APP/PS1). Here, we performed 16S rRNA amplicon sequencing and liquid chromatography-mass spectrometry to analyze changes in the microbiome and serum metabolome following magnesium-L-threonate exposure in a similar mouse model. Magnesium-L-threonate modulated the abundance of three genera in the gut microbiota, decreasing Allobaculum and increasing Bifidobacterium and Turicibacter. We also found that differential metabolites in the magnesium-L-threonate-regulated serum were enriched in various pathways associated with neurodegenerative diseases. The western blotting detection on intestinal tight junction proteins (zona occludens 1, occludin, and claudin-5) showed that magnesium-L-threonate repaired the intestinal barrier dysfunction of APP/PS1 mice. These findings suggest that magnesium-L-threonate may reduce the clinical manifestations of Alzheimer’s disease through the microbiota-gut-brain axis in model mice, providing an experimental basis for the clinical treatment of Alzheimer’s disease.

摘要

腸道菌群-腸-腦軸的失衡可能促進阿茲海默症的發展。近期研究發現，鎂-L-蘇糖酸鹽對老年及阿茲海默症模型小鼠的學習與記憶具有保護作用。然而，鎂-L-蘇糖酸鹽對阿茲海默症腸道菌群的影響仍不清楚。我們先前的研究顯示，鎂-L-蘇糖酸鹽可改善阿茲海默症雙轉基因 (APP/PS1) 小鼠的認知能力，並減少氧化壓力與發炎反應。本研究進一步利用 16S rRNA 擴增子定序與液相層析-質譜法 (LC-MS) 分析鎂-L-蘇糖酸鹽處理後的小鼠腸道微生物群與血清代謝組變化。結果顯示，鎂-L-蘇糖酸鹽調節了腸道菌群中三種屬的豐度，降低 Allobaculum，並增加 Bifidobacterium 與 Turicibacter。此外，我們發現鎂-L-蘇糖酸鹽調控的血清差異代謝物富集於多條與神經退行性疾病相關的代謝途徑。透過西方墨點法檢測腸道緊密連接蛋白 (ZO-1、occludin 及 claudin-5)，結果顯示鎂-L-蘇糖酸鹽可修復 APP/PS1 小鼠的腸道屏障功能障礙。本研究結果表明，鎂-L-蘇糖酸鹽可能透過腸道菌群-腸-腦軸減緩阿茲海默症模型小鼠的臨床表現，為阿茲海默症的臨床治療提供實驗依據。

前言

阿茲海默症 (AD) 是最嚴重的老年疾病之一，與心血管疾病及腫瘤並列為主要死因之一 (Tiwari et al., 2019)。作為一種極為複雜、多因素且涉及多重機制的疾病，AD 受多種基因及靶點影響，並可由多種因素誘發 (Holtzman et al., 2011)。人體內存在大量細菌與其他微生物，統稱為腸道菌群，這些微生物及其基因組共同構成了腸道微生物組。腸道微生物組在調節免疫系統等身體機能方面發揮重要作用 (Wu and Wu, 2012)。腸道菌群-腸-腦軸 (microbiome-gut-brain axis) 指腸道微生物對腸-腦軸功能的影響 (Liu et al., 2022; Claudino Dos Santos et al., 2023)。微生物可透過調節免疫因子與代謝物的循環影響神經通路，進而影響神經退行性疾病。腸道菌群-腸-腦軸在腸道與大腦之間的資訊傳遞中扮演關鍵角色 (Carabotti et al., 2015)。

內外環境的變化，尤其是長期使用廣譜抗生素，可能抑制敏感腸道細菌的生長，使其他細菌過度增殖，導致菌群失衡。此時，正常生理平衡被破壞，使病原體得以入侵並累積有毒代謝物。越來越多證據顯示，腸道菌群失衡與中樞神經系統 (CNS) 疾病的發病機制相關 (Alsegiani and Shah, 2022; Chidambaram et al., 2022b)。臨床研究亦證實，神經退行性疾病發展的最初幾年內，患者經常出現腸胃道症狀 (Katsuno et al., 2018)。病原體與有毒代謝物進入全身循環，導致葡糖腦苷酶功能失調及慢性神經發炎，進一步誘發免疫活化失衡，使神經毒性錯誤折疊蛋白釋放至全身循環 (Kaur et al., 2021)。這些蛋白質在中樞神經系統細胞內外的累積，最終導致神經元死亡。研究已發現腸道菌群失調與神經退行性疾病的惡化及擴散存在直接關聯 (Chidambaram et al., 2022a)。

腸道細菌能影響大腦功能，誘發神經退行性疾病，並影響免疫與神經系統的相互作用，改變免疫調節機制 (Fung et al., 2017; Ichikawa et al., 2023)。在 AD 患者的大腦澱粉樣斑塊及其周圍血管中發現的脂多醣 (lipopolysaccharides) 亦為促發炎化合物。腸道菌群可產生具有抗發炎及神經保護作用的代謝物 (Marizzoni et al., 2020)。2017 年的一項研究發現，AD 患者的腸道菌群組成與健康人存在顯著差異，其中某些細菌的含量與 AD 相關生物標誌物在腸道與腦脊髓液中的濃度呈正相關 (Mothapo et al., 2017)。此外，AD 患者的腸道菌群多樣性降低，部分細菌比例過高，而另一些則大幅減少 (Marizzoni et al., 2020; Trejo-Castro et al., 2022)。

鎂是人體內第四大陽離子，調節多種離子通道的電子流動，並催化多種生物與化學反應 (Jahnen-Dechent and Ketteler, 2012)。鎂可透過抑制鈉鉀 ATP 酶及鎂 ATP 酶，調控中樞神經系統的神經傳導物質，如兒茶酚胺、鴉片受體及神經 DNA 受體，從而影響中樞神經功能，並透過荷爾蒙調節神經系統 (Abumaria et al., 2011)。我們先前的研究顯示，鎂-L-蘇糖酸鹽 (MgT) 作為一種膳食補充劑，能夠在 AD 雙轉基因小鼠 (APP/PS1) 中發揮顯著的神經保護作用，減少氧化壓力 (Xiong et al., 2022)。

由於腸道菌群與鎂均參與 AD 調控，我們推測 MgT 攝取可能透過與腸道菌群的相互作用來改善 AD。儘管 MgT 對腸道菌群的影響尚未被研究，但已有研究發現，膳食鎂補充可影響腸道菌群的豐度 (Piuri et al., 2021)。因此，本研究旨在探討 MgT 是否透過調節腸道菌群-腸-腦軸來改善 AD，並聚焦於其對 APP/PS1 小鼠腸道菌群的影響。我們利用蘇木精-伊紅 (H&E) 染色分析 MgT 處理後 APP/PS1 小鼠的結腸組織，以評估發炎因子及氧化壓力指標。此外，我們使用 16S rRNA 擴增子定序與液相層析-質譜法 (LC-MS) 來分析這些小鼠腸道微生物組及血清代謝組的變化。

方法

實驗動物

本研究使用 6 個月齡、體重 20–25 g 的雄性 APP/PS1 轉基因小鼠 (庫存號: 110322220100981143，RRID: MMRRC_034829-JAX) 及年齡、性別匹配的野生型 C57BL/6J 小鼠 (庫存號: 110324220102277936，RRID: IMSR_JAX:000664)，均購自北京維通利華實驗動物技術有限公司 (中國北京，許可證號: SCXK (京) 2019-0009)。本研究選擇雄性小鼠，參考了先前已發表的實驗方案 (Xiong et al., 2022; Zhang et al., 2023)。

在 12 小時黑暗週期內，小鼠被單獨飼養於通風良好的籠內，可自由攝取食物與飲水，飼養環境溫度維持在 22–25°C，相對濕度控制在 50–60%。所有實驗操作均獲得中山大學動物實驗倫理委員會批准 (批准號: SYSU-IACUC-2020-B1017，批准日期: 2020 年 8 月 25 日)，並遵循《動物研究：活體實驗報告指南》(ARRIVE) 進行設計與報告 (Percie du Sert et al., 2020)。

藥物處理

小鼠隨機分為三組 (每組 n = 5): 野生型 C57BL/6J 小鼠 (WT)、APP/PS1 小鼠 (APP/PS1) 及接受鎂-L-蘇糖酸鹽 (MgT) 處理的 APP/PS1 小鼠 (MgT)。MgT (貨號: M843873，廣州永瑾生物科技有限公司，中國廣東廣州) 以 910 mg/kg 的劑量透過飲水每日給予 MgT 組，具體方法參考先前研究 (Xiong et al., 2022)。其餘兩組小鼠則僅提供普通飲水。

在持續 1 個月的 MgT 或對照處理後，小鼠接受莫里斯水迷宮測試，隨後以腹腔注射 150 mg/kg 戊巴比妥鈉 (上海三熙生物科技有限公司) 深度麻醉後犧牲，並收集結腸組織、糞便及血清樣本進行進一步分析 (圖 1)。

圖 1：實驗流程圖

APP/PS1：類澱粉蛋白前驅物及突變型人類早老素 1；ELISA：酶聯免疫吸附測定；H&E：蘇木精-伊紅染色；LC-MS：液相層析-質譜法；MgT：鎂-L-蘇糖酸鹽；WT：野生型。

莫里斯水迷宮測試

莫里斯水迷宮測試用於評估空間記憶與學習能力 (Liu et al., 2019)。實驗使用一個圓形水池 (廣州頤潤瑞生物科技有限公司，中國廣東廣州)，水池半徑 60 cm、高 50 cm，並劃分為四個象限。隱藏的逃生平台 (半徑 4.5 cm) 設置於其中一個象限的中央，距水面 2 cm。WT 組與 APP/PS1 組的小鼠水池均加入二氧化鈦染色，水溫維持在 22°C。水池置於光線較暗、隔音的房間內，並設有多個視覺線索。

定向航行測試連續進行 5 天，將小鼠從不同的起始位置放入水池中，允許其游動至隱藏平台，每天進行 4 次試驗，每次間隔 30 分鐘。測試使用中國醫學科學院研發的電腦控制視頻追蹤系統記錄小鼠到達平台的延遲時間及游泳軌跡，最大測試時間為 90 秒。若小鼠未能找到平台，則直接將其放置於平台上停留 15 秒。逃避潛伏期 (escape latency) 以小鼠從起始點游至平台所需時間計算。第 6 天，移除平台，小鼠從與原平台對側的象限放入水池，在 90 秒內自由探索水迷宮。

結腸組織氧化壓力與發炎指標評估

結腸組織樣本以 1 mL 冷卻的 1× 磷酸鹽緩衝鹽水 (PBS) 均質化，並以冷 PBS 沖洗去除多餘血液。均質液以 5000 × g 離心 5 分鐘，取上清液進行分析。

  • 發炎因子檢測：使用酶聯免疫吸附測定 (ELISA) 試劑盒 (江蘇美曼實業有限公司，中國江蘇南京) 測定促發炎細胞激素腫瘤壞死因子 (TNF)-α、白介素 (IL)-1β，以及抗發炎細胞激素 IL-10。
  • 氧化指標測定：使用分光光度法試劑盒 (江蘇美曼實業有限公司) 測定氧化壓力指標，包括丙二醛 (MDA)、過氧化氫酶 (CAT) 和超氧化物歧化酶 (SOD)。

所有測試均依照試劑盒製造商的指引進行。ELISA 與分光光度法結果分別使用 Thermo Labsystems Multiskan MS 352 微量酶標儀 (Ascent，芬蘭) 及全自動生化分析儀 (AU480，Beckman Coulter Ltd.，美國加州帕薩迪納) 進行檢測。

糞便 DNA 萃取與 16S rRNA 定序

使用 20–30 ng DNA 擴增細菌 16S 核糖體 DNA (rDNA) V3–V4 超可變區。引物由深圳美基因有限公司 (中國廣東深圳) 設計，16S rDNA 擴增的正向及反向引物分別為：

  • 正向：5′-ACT CCT ACG GGA GGC AGC A-3′
  • 反向：5′-GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3′

聚合酶鏈式反應 (PCR) 擴增進行三次重複，每次反應體積包含：

  • 2.5 μL TransStart 緩衝液 (TransGen，北京，中國)
  • 2.5 μL TransStart Taq DNA 聚合酶 (含 2 μL dNTPs)
  • 1 μL 每個引物 (100 μM)
  • 20–30 ng 模板 DNA

為產生帶有索引的文庫，擴增產物末端連接索引接頭。PCR 產物的品質控制使用 Qubit 3.0 螢光計 (Invitrogen，美國加州卡爾斯巴德) 進行，並定量至 10 nmol 以進行後續新一代定序。DNA 文庫根據製造商指引裝載至 Illumina MiSeq 平台 (美國加州聖地牙哥)，並使用 250 碱基對雙端模式進行定序。

原始讀序使用 FastP 軟體 (版本 0.18.0) 修剪以產生乾淨讀序 (Chen et al., 2018)，隨後使用 FLASH 軟體 (版本 1.2.11) 組裝為原始標籤 (Magoč and Salzberg, 2011)。經嵌合體過濾後，使用 USEARCH 軟體 (版本 9.2.64) 依據相似性將有效標籤聚類為操作分類單元 (OTUs) (Edgar, 2010)。序列分類基於 16S rRNA 資料庫 (Silva v138)，使用 RDP OTU 分類器 (版本 2.2)，並設置信心水準閾值為 0.7 (Pruesse et al., 2007; Wang et al., 2007)。

微生物群落分析

在微生物群落分析中，我們排除序列讀數低於 0.005% 的 OTUs。α 多樣性指數使用 QIIME 計算 (Caporaso et al., 2010)，並利用 R 軟體 vegan 套件 (版本 2.5.3) 透過 Tukey HSD (誠實顯著性差異) 檢定進行組間比較 (Oksanen et al., 2022)。

Bray–Curtis 距離的主座標分析 (PCoA) 於 R 軟體 vegan 套件 計算，並使用 ggplot2 套件 (版本 2.2.1) 繪製圖表 (Wickham, 2016)。組間相似性分析 (ANOSIM) 的統計檢定亦透過 R 軟體 vegan 套件 進行。微生物群落組成的堆疊條形圖使用 ggplot2 套件 視覺化。

生物標誌特徵的線性判別分析效應大小 (LEfSe) 分析使用以下閾值：線性判別分析 (LDA) 分數 (log10) > 3，P 值 < 0.05。OTUs 的 KEGG (京都基因與基因組百科全書) 途徑分析 使用 Tax4Fun (版本 1.0) 進行 (Aßhauer et al., 2015)。組間功能差異透過 Welch t 檢定 (R 軟體 vegan 套件) 分析。

血清代謝物萃取與 LC-MS 分析

血清樣本解凍後震盪 10 秒，取 50 μL 震盪樣本置於離心管，加入 300 μL 20% 乙腈-甲醇 內標萃取液，震盪 3 分鐘後以 14,000 × g 於 4°C 離心 10 分鐘。取 200 μL 上清液轉移至新離心管，於 –20°C 靜置 30 分鐘，再以 12,000 r/min 於 4°C 離心 3 分鐘，取 180 μL 上清液轉入樣品瓶，進行色譜分析。

代謝體分析 由 深圳美基因有限公司 進行，使用 Agilent UHPLC 1290 Infinity-Triple Quad MS 6460 (Agilent Technologies Inc., 美國加州聖塔克拉拉)，其電噴霧電離源 (ESI) 以 0.1% 甲酸水溶液 (A 相) 與乙腈 (B 相) 為流動相，在 Zorbax SB-C18 色譜柱 (Agilent Technologies Inc.) 內分離代謝物。

梯度洗脫條件 為：

  • 0–0.5 分鐘：5% (v/v) B
  • 0.5–2 分鐘：10% B
  • 2–5 分鐘：40% B
  • 2–5 分鐘：90% B
  • 流速：0.3 mL/min，柱溫：40°C

質譜參數：

  • 毛細管電壓：4.0 kV
  • 噴霧壓力：45 psi
  • 氣體溫度：300°C
  • 護套氣體溫度：350°C
  • 氣流速率：13 L/min

原始數據轉換為 mzML 格式 (ProteoWizard 軟體)，並使用 XCMS 程式 進行峰提取、比對與保留時間校正。支援向量回歸 (SVR) 修正峰面積，並排除缺失值超過 50% 的代謝物。代謝物鑑定來自 內部數據庫、公共數據庫及 AI 預測庫。

統計分析：

  • 偏最小平方判別分析 (PLS-DA) 透過 R 軟體 models 套件 比較組間差異
  • VIP (變數投影重要性) 分數 ≥ 1，t 檢定 P 值 < 0.05 判定差異代謝物
  • KEGG 途徑富集分析 透過 超幾何檢定，閾值設為 P < 0.05

微生物群與代謝體互作分析

使用 Spearman 相關係數 評估 差異菌屬 (genus level)、差異代謝物及促發炎/抗發炎細胞激素指標 的相關性。滿足 絕對相關值 > 0.5 且 P < 0.05 的關聯保留，並使用 Cytoscape v3.8.2 視覺化交互網絡 (Chen et al., 2009)。

結腸組織 H&E 染色

取自 10% 緩衝甲醛 固定的組織，經 酒精脫水，再以 石蠟包埋與切片。切片依 H&E 染色試劑盒 (貨號 G1003，Servicebio, 中國武漢) 進行染色，並使用 Leica Application Suite v4 (德國威茲勒) 觀察細胞。使用 Image-Pro Plus 6.1 軟體 (Media Cybernetics Inc., 美國馬里蘭州羅克維爾) 測定脂肪比例及空腸絨毛高度。

腸道屏障功能評估

測定 三種腸道緊密連接蛋白：

  • ZO-1 (緊密連接蛋白 1)
  • Occludin
  • Claudin-5

Western blot：

  • 結腸組織裂解於 新鮮製備的 RIPA 緩衝液 (50 mM Tris 緩衝鹽水, 0.5% 去氧膽酸鈉, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM PMSF)
  • 蛋白濃度使用 雙縮脲酸蛋白濃度測定試劑盒 (Solarbio, 北京, 中國) 測定
  • 50 μg 蛋白樣品經 SDS-PAGE 電泳 分離，轉印至 PVDF 膜 (Merck Millipore, 德國達姆施塔特)
  • 5% 牛血清白蛋白 (BSA) 於 0.1% Tween-20 的 pH 7.5 Tris 緩衝鹽水 中封閉 1 小時
  • 一抗孵育 (4°C 過夜)，再以 辣根過氧化酶標記的山羊抗體 (1:5000, 貨號 S0002, RRID: AB_2839430, Affinity Biosciences, 江蘇常州, 中國) 處理

主要一抗 (Affinity Biosciences, 中國)：

  • ZO-1 (1:500, 貨號 AF5145, RRID: AB_2837631)
  • Occludin (1:3000, 貨號 DF7504, RRID: AB_2841004)
  • Claudin-5 (1:3000, 貨號 AF5216, RRID: AB_2837702)
  • β-Actin (1:5000, 貨號 AF7018, RRID: AB_2839420)

蛋白條帶使用 超靈敏化學發光試劑 (Mikx Biotechnology, 上海, 中國) 於 iBright 凝膠成像系統 (Invitrogen) 觀察。

統計分析

數據使用 SPSS 軟體 (版本 17.0, SPSS Corporation, 美國伊利諾州芝加哥) 分析，結果以 均值 ± 標準誤 (SEM) 表示。多組比較採用 單因子變異數分析 (ANOVA) 與 Tukey HSD 檢定，顯著性水準設為 P < 0.05。

結果

MgT 改善 APP/PS1 小鼠的認知能力並緩解結腸氧化壓力與發炎反應

透過 莫里斯水迷宮測試 評估行為表現。與先前研究結果一致，MgT 處理可顯著 改善 APP/PS1 小鼠的認知缺陷 (圖 2A)。此外，MgT 亦能 顯著恢復 APP/PS1 小鼠的記憶功能，使其達到 WT 小鼠的水平 (圖 2B)。

進一步測量氧化與發炎指標，結果顯示：

  • 血清 MDA 水平顯著下降 (圖 2C)，表明氧化壓力降低。
  • 抗氧化因子 SOD 與 CAT 水平顯著上升 (圖 2D、E)，顯示抗氧化能力增強。
  • 促發炎細胞激素 TNF-α 與 IL-1β 顯著降低 (圖 2F、G)，表明發炎反應減弱。
  • 抗發炎細胞激素 IL-10 顯著增加 (圖 2H)，進一步支持 MgT 的抗發炎作用。
圖 2：MgT 對 APP/PS1 小鼠結腸氧化壓力與發炎相關損傷的保護作用

(A) 莫里斯水迷宮示意圖及各組小鼠的游泳軌跡 (綠線)。藍色圓圈代表平台，紅點表示小鼠起始位置。
(B) 各組小鼠的逃避潛伏期 (Escape latency time)。
(C–H) 各組小鼠的氧化與發炎指標，包括 MDA (C)、SOD (D)、CAT (E)、促發炎細胞激素 TNF-α (F)、IL-1β (G) 及抗發炎細胞激素 IL-10 (H)。

數據以 均值 ± SEM (n = 5) 表示，統計分析採用 單因子變異數分析 (ANOVA) 及 Tukey HSD 檢定；*P < 0.05，**P < 0.01。

縮寫說明：
APP/PS1：類澱粉蛋白前驅物及突變型人類早老素 1
CAT：過氧化氫酶
IL：白介素
MDA：丙二醛
MgT：鎂-L-蘇糖酸鹽
SOD：超氧化物歧化酶
TNF：腫瘤壞死因子
WT：野生型

MgT 調節 APP/PS1 小鼠的腸道菌群

透過 16S rDNA 高通量定序 分析三組小鼠的腸道菌群結構，共獲得 1216 個 OTUs。

α 多樣性分析 顯示，MgT 可顯著 增加 APP/PS1 小鼠的 Shannon 指數與 Simpson 指數 (圖 3A)。
β 多樣性主座標分析 (PCoA) 顯示 三組樣本分別聚類，表明組間菌群結構存在差異 (圖 3B)。
β 多樣性的 ANOSIM 檢定 進一步證實三組間的細菌多樣性存在顯著差異 (R = 0.86，P = 0.001；圖 3C)。

菌群組成分析顯示：

  • 門 (Phylum) 水平：與 APP/PS1 組相比，MgT 組 Proteobacteria (變形菌門) 和 Firmicutes (厚壁菌門) 含量降低，而 Bacteroidetes (擬桿菌門) 含量增加 (圖 3D)。
  • 屬 (Genus) 水平：MgT 組 Allobaculum 和 Desulfovibrio 含量降低，而 Bifidobacterium (雙歧桿菌屬) 含量增加 (圖 3E)。
圖 3：腸道菌群多樣性與群落組成的組間比較

(A) 三組小鼠腸道菌群的 α 多樣性，以 Richness、Chao、Simpson 和 Shannon 指數評估。小寫字母 a、b 表示顯著差異 (P < 0.05)，統計方法為單因子變異數分析 (ANOVA) 與 Tukey 最小顯著差異檢定。

(B) β 多樣性 PCoA 分析，基於 Bray-Curtis 距離矩陣計算細菌分類單元的相對豐度。PCoA 圖中，每個點代表一個樣本，不同組別以不同顏色區分。

(C) β 多樣性 ANOSIM 檢定，比較不同組別間的微生物群落差異。

(D, E) 三組小鼠的腸道菌群組成，分別顯示於 門 (Phylum) 水平 (D) 及屬 (Genus) 水平 (E)。

縮寫說明：
MgT：鎂-L-蘇糖酸鹽
PCoA：主座標分析
WT：野生型

接下來，我們使用 LEfSe 分析來評估與 MgT 治療相關的生物標記。與 APP/PS1 組相比，MgT 組中 Breve、Pseudolongum、放線菌門 (Actinobacteria)、雙歧桿菌目 (Bifidobacteriales) 及雙歧桿菌科 (Bifidobacteriaceae) 的豐度增加。同時，MgT 組中 Allobaculum、厚壁菌科 (Erysipelotrichaceae) 及其他菌群的豐度則較 APP/PS1 組降低 (圖 4A)。MgT 組與 APP/PS1 組之間的功能菌群通路差異主要體現在氧化磷酸化功能、D-丙氨酸代謝功能及 ATP 結合盒 (ABC) 運輸蛋白功能相關通路。其中，ABC 運輸蛋白功能的差異最為顯著，這表明運輸蛋白的表達調控可能與 MgT 的治療機制相關 (圖 4B)。

圖 4：MgT 組與 APP/PS1 組小鼠腸道菌群及相關功能通路豐度的差異。

(A) 糞便菌群的 LEfSe 分析 LDA 分數 (篩選標準：log10 > 3，P < 0.05)，顯示 MgT 組與 APP/PS1 組之間的顯著差異。
(B) 透過 Welch’s t 檢定確定 MgT 組與 APP/PS1 組腸道菌群的功能通路豐度差異。

APP/PS1：類澱粉蛋白前驅物 (Amyloid-β precursor protein) 及突變型人類早老蛋白 1 (mutant human presenilin 1)；
LDA：線性判別分析 (linear discriminant analysis)；
MgT：左旋肉鹼鎂 (magnesium-L-threonate)。

MgT 改變了 APP/PS1 小鼠的血清代謝物

我們在所有組別的小鼠血清代謝組中共檢測到 930 種代謝物 (附表 1)。PLS-DA 分析圖顯示三組小鼠血清代謝物的差異 (圖 5A、B)。三組之間的差異代謝物比較顯示，MgT 與 WT 組的比較中差異代謝物數量最少，僅有 8 種代謝物上調，1 種代謝物下調 (圖 5C)。APP/PS1 組與 WT 組及 MgT 組之間的差異代謝物熱圖分別顯示於圖 6A、B。與 APP/PS1 組相比，MgT 組富集的差異代謝物 KEGG 通路主要與代謝相關，同時也涉及與神經退行性疾病相關的關鍵通路，包括鞘脂信號傳導 (sphingolipid signaling)、帕金森氏症 (Parkinson’s disease)、神經活性配體-受體相互作用 (neuroactive ligand-receptor interaction) 等 (圖 6C)。

圖 5：MgT 治療對 APP/PS1 小鼠血清代謝物的顯著影響

(A) 三組小鼠血清代謝物的 PLS-DA 分析圖。
(B) 三組所有樣本中檢測到的代謝物相對豐度熱圖。
(C) 各組比較中差異上調與下調的代謝物數量。

APP/PS1：類澱粉蛋白前驅物 (Amyloid-β precursor protein) 及突變型人類早老蛋白 1 (mutant human presenilin 1)；
MgT：左旋肉鹼鎂 (magnesium-L-threonate)；
PLS-DA：偏最小平方判別分析 (partial least squares discriminant analysis)。

圖 6：三組小鼠之間差異代謝物的功能分析

(A) APP/PS1 組與 WT 組之間的差異代謝物熱圖。
(B) APP/PS1 組與 MgT 組之間的差異代謝物熱圖。
(C) MgT 組與 APP/PS1 組之間的差異代謝物 KEGG 通路富集分析。

APP/PS1：類澱粉蛋白前驅物 (Amyloid-β precursor protein) 及突變型人類早老蛋白 1 (mutant human presenilin 1)；
KEGG：京都基因與基因組百科全書 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)；
MgT：左旋肉鹼鎂 (magnesium-L-threonate)；
WT：野生型 (wild-type)。

圖 7：MgT 在 APP/PS1 小鼠中調控的腸道菌群與代謝物之間的關係

(A, B) 三種細菌屬的豐度與氧化壓力及炎症指標 (A) 和差異代謝物 (B) 之間的相關性，顯示 MgT 組與 APP/PS1 組的差異。
(C) 氧化壓力與炎症指標與這些差異代謝物豐度之間的相關性。顯著相關性以 *P < 0.05、**P < 0.01、***P < 0.001 表示。
(D) 互作網絡示意圖，顯示這些重要細菌屬和差異代謝物在氧化壓力與炎症反應調控中的作用。

APP/PS1：類澱粉蛋白前驅物 (Amyloid-β precursor protein) 及突變型人類早老蛋白 1 (mutant human presenilin 1)；
CAT：過氧化氫酶 (catalase)；
IL：介白素 (interleukin)；
MDA：丙二醛 (malondialdehyde)；
MgT：左旋肉鹼鎂 (magnesium-L-threonate)；
SOD：超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase)；
TNF：腫瘤壞死因子 (tumor necrosis factor)。

MgT 保護 APP/PS1 小鼠免受腸道病變及屏障功能障礙影響

為探討 MgT 對 APP/PS1 小鼠腸道病變的影響，我們檢查了結腸的組織病理學變化。H&E 染色結果顯示，WT 組的結腸黏膜上皮完整，腸腺豐富且排列緊密，杯狀細胞數量充足，細胞形態無明顯異常。APP/PS1 組則觀察到輕微的黏膜上皮細胞損傷，核染色加深並呈現固縮現象，細胞質嗜伊紅性增強，偶見少量炎性細胞浸潤固有層。而在 MgT 治療組中，黏膜上皮完整，腸腺豐富且排列緊密，杯狀細胞數量充足，細胞形態正常，無明顯異常 (圖 8A)。

圖 8：MgT 對 APP/PS1 小鼠腸道病變及屏障功能障礙的保護作用

(A) 三組小鼠代表性結腸組織的蘇木精-伊紅 (H&E) 染色。與 WT 組及 MgT 組相比，APP/PS1 組顯示輕微的黏膜上皮細胞損傷、核染色加深並固縮 (黑色箭頭)、細胞質嗜伊紅性增強，以及固有層輕微的炎性細胞浸潤 (紅色箭頭)。
(B) WT、APP/PS1 及 MgT 組中 ZO-1、occludin 及 claudin-5 蛋白表達的 Western blot 檢測及定量分析。數據以平均值 ± SEM (n = 3) 表示，採用單因子方差分析 (one-way ANOVA) 並經 Tukey HSD 檢定分析，*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，與 APP/PS1 組相比。

APP/PS1：類澱粉蛋白前驅物 (Amyloid-β precursor protein) 及突變型人類早老蛋白 1 (mutant human presenilin 1)；
MgT：左旋肉鹼鎂 (magnesium-L-threonate)；
WT：野生型 (wild-type)；
ZO-1：緊密連接蛋白 1 (zona occludens 1)。

討論

腸道菌群與神經、免疫及內分泌系統持續互動，以確保各系統的正常發展與功能 (Maranduba et al., 2015; Ma et al., 2019; Ghosh and Pramanik, 2021; Pluta and Januszewski, 2023)。此類溝通的重要性可透過「腸道-腦軸」來解釋，這是一個雙向溝通網絡，連結腸道與中樞神經系統 (CNS)，並決定個體的健康狀態 (Fernández-Tomé et al., 2021)。該雙向軸於嬰幼兒時期形成，並受到飲食、壓力等環境與生活方式因素影響。此外，它對維持體內平衡至關重要，進而影響健康與老化 (Larroya et al., 2021)。因此，與腸道菌群失衡、腸道屏障受損及發炎狀態相關的變化，將影響免疫、內分泌及神經系統，甚至影響全身健康。此外，該機制還與多種病理狀況相關，包括腦功能異常 (Hou et al., 2022)。隨著年齡增長，發炎系統老化會導致菌群與體內平衡的惡化，進而增加與老化相關疾病 (如神經退行性疾病) 的風險 (Rea et al., 2018)。目前，腸道-腦軸已被認為是阿茲海默症 (AD) 發病機制中的關鍵角色，也是預防與延緩 AD 進展的重要研究方向。

鎂參與超過 300 種生化反應，並已成為腦部健康研究的焦點 (Fiorentini et al., 2021)。鎂可恢復神經細胞健康，近期臨床研究顯示，補充鎂後記憶與認知能力顯著改善 (Wang et al., 2013)。左旋肉鹼鎂 (MgT) 天然存在於體內與腦內，是一種有效的補充劑，可提升腦內鎂含量，進而預防神經退行並恢復腦功能 (Kirkland et al., 2018; Bislimi et al., 2021)。此外，MgT 也被證實具有治療神經退行性疾病的潛力 (Sahebnasagh et al., 2022)。本研究結果顯示，MgT 治療顯著保護 APP/PS1 小鼠結腸免受氧化壓力與炎症損傷。例如，MgT 可顯著恢復腸道杯狀細胞的豐度並降低多種發炎因子的水平。已有研究指出，腸道杯狀細胞與發炎因子與特定菌群豐度相關 (Mothapo et al., 2017; Fernández-Tomé et al., 2021; Xiong et al., 2022)。深入研究進一步證實，MgT 可透過調控腸道菌群豐度來改善腸道發炎反應，並透過腸道-腦軸調節神經細胞的發炎狀態，進而改善神經退行 (Wang et al., 2013; Liu et al., 2021; Xiong et al., 2022)。這些研究結果進一步闡明了 MgT 在臨床治療中的神經保護機制。

本研究發現，MgT 治療前後豐度變化最明顯的腸道菌群為 Allobaculum、雙歧桿菌屬 (Bifidobacterium) 和 Turicibacter，皆屬於厚壁菌門 (Firmicutes)。AD 相關的腸道菌群多樣性研究顯示，AD 患者與健康對照組在擬桿菌門 (Bacteroidetes) 和厚壁菌門的豐度比率上存在差異 (Vogt et al., 2017)。具體而言，AD 患者的擬桿菌門豐度較高，且與 AD 呈正相關，而厚壁菌門較低，與 AD 呈負相關。有趣的是，在本研究中，MgT 治療顯著降低了 APP/PS1 小鼠的厚壁菌門豐度，並增加了擬桿菌門的豐度。厚壁菌門的減少會誘發與糖酵解代謝異常相關的炎症反應 (Soto-Heredero et al., 2020; Stojanov et al., 2020)。本研究中，APP/PS1 小鼠的關鍵葡萄糖與脂質代謝中間產物 (如脂質、異白胺酸、乳酸、丙胺酸、麩醯胺酸、肌酸及葡萄糖) 亦發生變化，這些代謝物與 AD 患者密切相關 (Sato and Morishita, 2015)。此外，葡萄糖與膜脂質代謝分別為神經元提供能量並維持細胞膜穩定性 (Tracey et al., 2018)。本研究發現，MgT 治療後的 APP/PS1 小鼠，其葡萄糖代謝與脂質代謝部分恢復至 WT 組的水平。透過腸道菌群與代謝組學分析，我們辨識出 AD 模型小鼠與 WT 小鼠之間的菌群與代謝物差異，進一步解析了 MgT 在 AD 保護機制中的作用，為 AD 的預防與治療提供了新的藥效學見解。

此外，本研究亦證實 MgT 可保護 APP/PS1 小鼠的腸道免受病變影響，此現象可能廣泛存在於記憶與學習受損的小鼠模型中 (Bislimi et al., 2021; Fernández-Tomé et al., 2021)。在 APP/PS1 小鼠的腸道上皮細胞中，緊密連接蛋白 ZO-1、occludin 和 claudin-5 表達下調，可能導致屏障功能受損，而此損傷可能因小鼠體內的發炎狀態進一步惡化。因此，MgT 可透過調控腸道菌群，不僅抑制炎症，還能恢復緊密連接蛋白的表達，進而保護腸道-腦軸。然而，由於本研究僅使用雄性小鼠，結果可能存在性別偏倚，未來應進一步比較 MgT 在不同性別中的作用差異。

腸道菌群代謝與中樞神經系統之間存在複雜且緊密的關聯，而 MgT 透過調控腸道菌群豐度可能對中樞神經系統具有保護作用 (Suganya and Koo, 2020; Ojeda et al., 2021)。然而，目前尚不清楚哪些益生菌與益生元對中樞神經系統訊號傳導具有保護作用，亦不清楚具體的神經傳導調控機制，這些問題仍需進一步探索。未來，腸道菌群可能成為神經退行性疾病調控的重要目標，包括益生菌、益生元及 MgT 等腸道菌群調節產品，皆可能為 AD 治療提供新的方向，但仍需進行長期的人群研究。此外，APP/PS1 小鼠記憶功能的恢復是否直接與腸道菌群變化或血液中鎂離子濃度相關，仍需進一步研究來驗證。

總結而言，MgT 治療可透過調控腸道菌群的種類與豐度，抑制腸道炎症相關因子的分泌，進一步影響大腦神經元活動，從而延緩小鼠 AD 症狀的進展。本研究確立了 MgT 的治療作用與腸道-腦軸調節之間的關聯性，為 AD 的預防與治療提供了新的研究方向。

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