研究揭示：RalA活性增加導致肥胖者白色脂肪細胞線粒體功能失調

本翻譯僅作學術交流用，無商業意圖，請勿轉載，如有疑議問請來信

一項最新研究發現，小GTPase RalA的活性增加會導致肥胖者白色脂肪細胞中的線粒體碎片化和氧化能力降低。通過在肥胖小鼠中敲除RalA基因，可防止線粒體碎片化，並提高脂肪酸氧化率，進而抵抗高脂飲食引起的體重增加和改善葡萄糖耐量及肝功能。這表明RalA在肥胖相關的代謝功能失調中起著關鍵作用。

Obesity-dependent increase in RalA activity disrupts mitochondrial dynamics in white adipocytes

肥胖依賴性 RalA 活性增加破壞白色脂肪細胞的粒線體動態

Xia W, Veeragandham P, Cao Y, et al. Obesity-dependent increase in RalA activity disrupts mitochondrial dynamics in white adipocytes. Preprint. Res Sq. 2023;rs.3.rs-2923510. Published 2023 Jun 2. doi:10.21203/rs.3.rs-2923510/v1

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10312969/

Abstract

Mitochondrial dysfunction is a characteristic trait of human and rodent obesity, insulin resistance, and fatty liver disease. Here we report that mitochondria undergo fragmentation and reduced oxidative capacity specifically in inguinal white adipose tissue after feeding mice high fat diet (HFD) by a process dependent on the small GTPase RalA. RalA expression and activity are increased in white adipocytes from mice fed HFD. Targeted deletion of Rala in white adipocytes prevents the obesity-induced fragmentation of mitochondria and produces mice resistant to HFD-induced weight gain via increased fatty acid oxidation. As a result, these mice also exhibit improved glucose tolerance and liver function. In vitro mechanistic studies revealed that RalA suppresses mitochondrial oxidative function in adipocytes by increasing fission through reversing the protein kinase A-catalyzed inhibitory Ser637phosphorylation of the mitochondrial fission protein Drp1. Active RalA recruits protein phosphatase 2A (PP2Aa) to specifically dephosphorylate this inhibitory site on Drp1, activating the protein, thus increasing mitochondrial fission. Adipose tissue expression of the human homolog of Drp1, DNML1, is positively correlated with obesity and insulin resistance in patients. Thus, chronic activation of RalA plays a key role in repressing energy expenditure in obese adipose tissue by shifting the balance of mitochondrial dynamics towards excessive fission, contributing to weight gain and related metabolic dysfunction.

摘要

粒線體功能障礙是人類及鼠類肥胖、胰島素阻抗和脂肪肝疾病的特徵之一。本研究報告指出，小GTP酶RalA在高脂飲食（HFD）餵食小鼠後，依賴RalA的過程使腹股溝白色脂肪組織的粒線體碎裂及氧化能力降低。餵食HFD的小鼠白色脂肪細胞中，RalA的表達及活性增加。定向刪除白色脂肪細胞中的RalA可防止肥胖引起的粒線體碎裂，使小鼠透過增加脂肪酸氧化而對HFD誘導的體重增加具抵抗力。結果，這些小鼠表現出改善的葡萄糖耐受性及肝功能。體外機制研究顯示，RalA透過逆轉蛋白激酶A催化的粒線體分裂蛋白Drp1抑制性Ser637磷酸化，增加粒線體分裂，從而抑制脂肪細胞的粒線體氧化功能。活性RalA招募蛋白磷酸酶2A（PP2Aa）來特異性地去磷酸化Drp1上的這個抑制位點，激活該蛋白，從而增加粒線體分裂。人體Drp1同源物DNML1的脂肪組織表達與肥胖和患者的胰島素阻抗正相關。因此，RalA的慢性活化在肥胖脂肪組織中通過過度分裂粒線體來抑制能量消耗，促進體重增加及相關的代謝功能障礙。

總結

肥胖已成為全球流行病，顯著增加了2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝炎及其他心代謝異常的發生率。在肥胖發展過程中，白色脂肪組織（WAT）持續擴張並經歷代謝變化，特徵包括激素不敏感、炎症、纖維化和細胞凋亡。雖然粒線體在健康脂肪細胞中扮演重要的代謝角色，氧化燃料以產生ATR並在熱生產過程中產生熱量，但肥胖者的粒線體功能受損。然而，驅動粒線體損傷的原因及其如何導致肥胖及其諸多併發症仍然未知。

肥胖與高胰島素血症及糖尿病相關，研究表明粒線體功能障礙、能量消耗減少與胰島素阻抗之間存在聯繫。在肥胖者的肌肉及脂肪組織中，觀察到粒線體氧化功能改變，肥胖者的脂肪細胞相比於正常體重者含有更少的粒線體。此外，肥胖者的肌肉中的粒線體是碎裂的。粒線體大小和數量的變化由融合和分裂的動態平衡控制。融合對於在能量需求變化時控制粒線體數量和完整性至關重要。由動力蛋白相關蛋白Drp1催化的分裂在細胞分裂期間介導粒線體分裂和質量控制。然而，許多非分裂細胞中也觀察到粒線體的融合和分裂，這表明這些過程的正確平衡對適應能量需求和維持穩態至關重要。

Ral GTP酶是Ras超家族成員，參與多種細胞過程。我們之前證明，RalA在脂肪細胞中被胰島素激活，並與外泌體複合物成員互作，將GLUT4小泡靶向至細胞膜進行對接和隨後的融合，導致葡萄糖攝取增加。胰島素通過抑制性磷酸化RalGAP複合物（RGC）及定位RGL2（RalA的鳥苷酸交換因子）激活RalA。通過定向刪除RalGAP蛋白Ralgapb體內激活RalA促進棕色脂肪組織（BAT）中的葡萄糖攝取，並顯著改善高脂飲食小鼠的葡萄糖穩態。同樣，定向刪除Ralgapa1改善餐後葡萄糖和脂質向肌肉的運送。

我們在此報告，肥胖小鼠的脂肪細胞中RalA基因及蛋白質表達和活性增加，並且定向刪除白色脂肪細胞中的RalA減輕了HFD誘導的肥胖，這是由於腹股溝白色脂肪組織（iWAT）中特異性地增加了能量消耗和粒線體氧化磷酸化。這些RalA刪除的有利效果是由逆轉HFD誘導的白色脂肪細胞粒線體分裂增加所驅動。體外研究顯示，RalA與PP2Aa互作，促進Drp1抑制性S637位點的去磷酸化，使Drp1活化，導致過度分裂和粒線體碎裂。綜上所述，這些數據顯示，在肥胖中持續升高的RalA在白色脂肪細胞中產生粒線體功能障礙，對全身代謝有深遠影響。

白色脂肪細胞特異性刪除 Rala 可保護小鼠免受高脂飲食誘導的肥胖

來自對照組及HFD餵食小鼠的分離成熟脂肪細胞的RNA-seq分析顯示，在肥胖發展期間，eWAT和iWAT的脂肪細胞中Rala表達顯著上調，而Ralgapa2表達則下調（圖1a,b）。此外，肥胖小鼠的iWAT成熟脂肪細胞中RalA蛋白含量增加（圖1c，擴展數據圖1a），伴隨RalA-GTP結合增加（圖1d，擴展數據圖1b）。我們還觀察到Ral GEF RGL2在脂肪組織中的表達與肥胖患者BMI之間趨向正相關（擴展數據圖1c,d）。這些觀察結果支持了在肥胖中脂肪細胞RalA活性持續升高的觀點。

圖1 白色脂肪細胞特異性刪除 Rala 可保護小鼠免受高脂飲食誘導的肥胖。

為了進一步探討 RalA 是否在葡萄糖穩態和能量代謝中扮演角色，我們透過將 Rala-floxed 小鼠與脂聯素-Cre 轉基因小鼠雜交，生成脂肪細胞特異性 Rala 基因剔除（RalaAKO）小鼠。與 Ralaf/f 同窩小鼠相比，RalaAKO 小鼠的 WAT 和 BAT 初級脂肪細胞中 RalA 蛋白減少超過 90%，整個 WAT 減少約 50%，而肝臟中沒有變化（擴展數據圖1e）。RalaAKO 小鼠的 WAT 中胰島素刺激的 RalA GTP 結合減少，初級脂肪細胞中也觀察到相同結果（擴展數據圖1f）。

我們透過分化來自對照組和KO小鼠的iWAT基質血管細胞生成初級白色脂肪細胞。如之前在3T3-L1脂肪細胞中所見，RalA的剔除完全阻止了GLUT4在胰島素作用下從細胞內部向細胞膜的轉運（擴展數據圖1g）。此外，KO細胞中的胰島素刺激的葡萄糖攝取顯著減少（擴展數據圖1h）。

在普通飲食（CD）餵食的小鼠中，脂肪細胞特異性刪除 Rala 對體重沒有影響，但這些小鼠的脂肪量和脂肪堆積量減少（擴展數據圖2a-c）。通常，iWAT的脂肪細胞顯著小於CD餵食小鼠的eWAT中的脂肪細胞。此外，CD餵食的小鼠中，RalaAKO小鼠的iWAT脂肪細胞比對照組小鼠小，而eWAT和BAT中的脂肪細胞在基因型之間沒有差異（擴展數據圖2d）。雖然RalaAKO小鼠在普通飲食中沒有顯示出葡萄糖耐受性差異，但相比於 Ralaf/f 小鼠，其胰島素耐受性略有降低（擴展數據圖2e,f）。RalaAKO 小鼠的胰島素水平和HOMA-IR與CD餵食的對照組小鼠沒有差異（擴展數據圖2g,h）。然而，當挑戰60%高脂飲食時，RalaAKO 小鼠的體重增加顯著低於對照同窩小鼠（圖1e）。RalaAKO 小鼠的脂肪量顯著減少，而瘦體重沒有變化（圖1f）。進一步分析顯示，RalaAKO 小鼠的 iWAT 重量顯著減少，而 eWAT 和 BAT 沒有差異（圖1g）。HFD 增加了所有脂肪存儲區中的脂肪細胞大小，但在 iWAT 中效果最為顯著；HFD 餵食的 RalaAKO 小鼠顯示出 iWAT 中脂肪細胞較對照組小鼠趨向較小的趨勢，但在 eWAT 或 BAT 中沒有（擴展數據圖2d）。HFD 餵食的 RalaAKO 小鼠顯示出比對照小鼠顯著改善的葡萄糖耐受性，胰島素耐受性沒有變化（圖1h,i），但胰島素水平降低，HOMA-IR 改善（圖1j,k）。在 HFD 或 CD 上，兩種基因型的小鼠空腹血糖水平相當（擴展數據圖2i,j）。

為了進一步研究在 HFD 餵食的 RalaAKO 小鼠中，哪種脂肪組織存儲區負責減少體重增加，我們透過將 RalA-floxed 小鼠與 UCP1-Cre 轉基因小鼠雜交，生成 BAT 特異性 Rala 基因剔除（RalaBKO）小鼠（擴展數據圖2k）。雖然 CD 餵食的 RalaBKO 小鼠顯示 BAT 重量減少，可能由於葡萄糖攝取減少，但與對照小鼠相比，脂肪量或脂肪存儲區重量沒有差異（擴展數據圖2l,m）。在普通飲食上的基因型之間，葡萄糖和胰島素耐受性測試（GTT 和 ITT）完全相同（擴展數據圖2n,o）。此外，在 HFD 餵食的 RalaBKO 小鼠中，體重、脂肪量、組織重量、GTT 或 ITT 沒有差異（擴展數據圖2p-t）。這些結果表明，WAT 尤其是 iWAT 中的 Rala 特異性刪除可保護小鼠免受肥胖影響。

白色脂肪組織中 RalA 的缺失改善了 HFD 誘導的肝脂肪變性

由於 HFD 餵食的 RalaAKO 小鼠顯示出改良的 GTT，而胰島素耐受性未顯著改變，我們推測其葡萄糖處理的改善是由於肝臟葡萄糖生成的減少。為了驗證這一假設，我們對 HFD 餵食的 Ralaf/f 和 RalaAKO 小鼠進行了丙酮酸耐受測試（PTT）。與對照組小鼠相比，RalaAKO 小鼠在接受丙酮酸挑戰後的葡萄糖波動顯著降低（圖2a）。肝臟葡萄糖生成基因 G6pc 和 Pepck 顯著下調（圖2b）。這些數據表明，脂肪組織特異性 Rala 刪除部分通過減少肝臟葡萄糖生成來改善葡萄糖穩態。

圖2 白色脂肪組織中 RalA 的缺失改善了 HFD 誘導的肝脂肪變性。

HFD 餵食的 RalaAKO 小鼠的肝臟重量和三酸甘油酯（TG）含量顯著低於對照組小鼠（圖2c,d）。H&E 和 Oil-Red-O 染色均顯示 RalaAKO 小鼠肝臟中脂質積累較少（圖2e）。與組織學結果一致，RalaAKO 小鼠肝臟中的脂質生成基因（Acc、Fasn、Scd1 和 Acsl1）表達顯著降低（圖2f）。然而，RalaAKO 小鼠的血漿瘦素水平（圖2g）和與脂肪酸氧化（FAO）相關的肝臟基因表達（圖2h）未發生變化。此外，RalaAKO 小鼠肝臟中炎症（Adgre1）和纖維化相關（Col1a1 和 Col3a1）基因表達水平較低（圖2i），天冬氨酸氨基轉移酶（AST）和丙氨酸氨基轉移酶（ALT）活性也較低（圖2j,k）。值得注意的是，我們未觀察到 RalaBKO 小鼠在 HFD 餵食下的肝臟重量與對照組之間的差異（擴展數據圖2r）。這些觀察結果表明，WAT 特異性刪除 Rala 系統性地調節脂質代謝，以改善肥胖中的肝脂肪變性和損傷。

WAT 中 RalA 缺失增加能量消耗和粒線體氧化磷酸化

為了探討為什麼脂肪組織 Rala 刪除可保護小鼠免受 HFD 誘導的肝脂肪變性、體重增加和葡萄糖不耐受，我們通過代謝籠研究調查了 RalaAKO 小鼠的能量代謝。雖然在 CD 餵食的小鼠中，脂肪細胞中的 Rala 刪除對能量代謝和食物攝取沒有影響（擴展數據圖3a-e），但 HFD 餵食的 RalaAKO 小鼠在黑暗期顯示出能量消耗（EE）顯著增加，這是通過使用體重作為共變數的 ANCOVA 確定的（圖3a）。相應地，與對照組相比，RalaAKO 小鼠的氧氣消耗量同樣增加（擴展數據圖3f），儘管在基因型之間呼吸交換率（RER）、活動量或食物攝取量沒有差異（擴展數據圖3g-i）。相比之下，不論是 CD 還是 HFD 餵食的 RalaBKO 小鼠在 EE、氧氣消耗、RER、活動量和食物攝取方面均與對照同窩小鼠相同（擴展數據圖3j-n）。這些觀察結果表明，特異性刪除 WAT 中的 Rala 增加了能量消耗。

圖3 白色脂肪組織中 RalA 的缺失增加了能量消耗和粒線體氧化磷酸化。

能量消耗的增加間接反映了粒線體氧化活性的增加。因此，我們評估了脂肪存儲區中粒線體蛋白的表達。RalaAKO 小鼠的 iWAT 中氧化磷酸化（OXPHOS）蛋白顯著增加（圖3b,c），但在 eWAT 中沒有變化（擴展數據圖3o,p）。RalaAKO 小鼠的 BAT 中複合物 I 和複合物 II 水平略有增加（擴展數據圖3q,r）。這可能是因為 RalaAKO 小鼠的系統性代謝改善，而不是細胞自主的 BAT 功能，因為 HFD 餵食的 RalaBKO 小鼠並未顯示出改善的代謝表型。在這方面，HFD 餵食的 RalaAKO 小鼠的血漿 FFA 和 TG 水平顯著降低（圖3d,e）。為了測試 iWAT 普遍變棕的可能性，我們也檢查了產熱標誌物。所有三個脂肪存儲區中，Ucp1、Cidea 和 Prdm16 的表達在基因型之間相同，表明 RalaAKO 小鼠的能量消耗改善並不反映米色脂肪組織的發展（擴展數據圖3s）。

在白色脂肪細胞中剔除 RalA 增加粒線體活性和脂肪酸氧化

我們進一步評估了 RalaAKO 小鼠能量代謝改善的機制，直接測量了脂肪細胞中的粒線體活性。基礎呼吸測量顯示，KO 小鼠 iWAT 分離的粒線體的氧氣消耗率（OCR）顯著高於對照組小鼠，但 Ralaf/f 和 RalaAKO 小鼠的 eWAT 粒線體的 OCR 相似（圖3f）。我們還注意到，KO 小鼠初級分化的脂肪細胞的基礎和最大呼吸均顯著增加，並且通過添加脂肪酸氧化（FAO）抑制劑 etomoxir，最大呼吸的差異被減弱（圖4a，擴展數據圖4a）。為了直接研究 RalA 是否在控制 FAO 中起作用，我們將細胞與（14C）標記的棕櫚酸（PA）共同培養，測量其氧化生成的酸溶性代謝物（ASM）或 CO2。在 WT 和 KO 白色脂肪細胞中，結果與 OCR 相一致，KO 脂肪細胞中的脂肪酸氧化顯著高於 WT 脂肪細胞（圖4b）。這些數據表明，在 WAT 中剔除 RalA 增加了粒線體氧化活性，從而增加了能量消耗。

圖4 在白色脂肪細胞中剔除 RalA 通過防止肥胖誘導的 iWAT 粒線體分裂，增加了粒線體活性和脂肪酸氧化。

為確保這些研究反映了 RalA 的活性，我們還從 Ralaf/f 小鼠生成了不朽化的前脂肪細胞系，並通過轉染 Ore 病毒誘導 Rala 的刪除。Ore 重組酶完全刪除了前脂肪細胞和完全分化的脂肪細胞中的 RalA（擴展數據圖4b）。BODIPY 染色顯示，來自 WT 和 KO 小鼠的初級和不朽化前脂肪細胞均完全分化。作為另一種方法，我們使用細胞通透性螢光染料 TMRM 進行活細胞成像，以檢測粒線體膜電位（MtMP），這反映了活性粒線體中的電子傳輸和氧化磷酸化。KO 脂肪細胞顯示出比 WT 脂肪細胞更高的 TMRM 信號強度（圖4c，擴展數據圖4c）。為了證明 TMRM 檢測活性粒線體膜去極化的能力，我們應用了 β3-腎上腺素能受體激動劑 CL316,243（CL）來誘導粒線體膜去極化。激動劑施用後，TMRM 信號迅速下降，這證實了 TMRM 僅染色活性粒線體（擴展數據圖4d）。

我們之前報告稱，脂解驅動脂肪細胞中的粒線體氧化代謝。為了排除脂解作為增加 Rala-KO 脂肪細胞氧化能力的主要驅動力的可能性，我們進行了體外和體內脂解測試。CL 強烈刺激了 KO 和 WT 不朽化脂肪細胞中 FFA 和甘油的釋放，其比例約為3:1（擴展數據圖4e,f）。此外，在 Ralaf/f 和 RalaAKO 小鼠中，CL 誘導的 FFA 和自由甘油生成沒有差異（擴展數據圖4g,h）。我們進一步測試了 RalaAKO 小鼠在抑制胰島素釋放 FFA 方面是否存在缺陷。胰島素在 WT 和 KO 細胞中均抑制了約50%的 CL 誘導的 FFA 釋放（擴展數據圖4e）。單次注射胰島素使對照組和 RalaAKO 小鼠的 FFA 水平下降至相同程度（擴展數據圖4i）。有趣的是，KO 脂肪細胞在 CL 存在下顯示血漿甘油水平略微下降，而 RalaAKO 小鼠則在 CL 存在下或禁食後顯示甘油釋放略有增加（擴展數據圖4f,h,j）。綜上所述，這些結果表明，缺乏 RalA 的脂肪細胞在不影響 FFA 供應的情況下增強了粒線體氧化活性。

針對性 Rala 基因剔除可保護 iWAT 中的粒線體免受肥胖誘導的分裂

在 HFD 餵食的 RalaAKO 小鼠中觀察到的粒線體氧化活性增加可能源於粒線體生合成的增加。與基因型相關的粒線體生合成基因在 WAT 中的表達相當（擴展數據圖5a,b）。粒線體生合成的主調控器 AMPK 的活性在 HFD 餵食的對照組和 RalaAKO 小鼠之間也相當（擴展數據圖5c-f）。除了生合成，粒線體功能還可以通過嚴格控制的融合和分裂事件進行動態形態變化，以適應能量需求。電子顯微鏡（EM）顯示，HFD 餵食的 WT 小鼠在 iWAT 中出現了更小的球形粒線體（圖4d），這與之前報導的肥胖脂肪細胞中粒線體功能和形態受損相一致。與體內代謝表型一致，脂肪細胞 Rala 刪除對 CD 餵食的小鼠 iWAT 中的粒線體形態影響不大（圖4d），但完全防止了 HFD 誘導的粒線體形態變化；這些小鼠 iWAT 中的粒線體顯示出與 CD 餵食的小鼠無異的延長形狀（圖4d）。事實上，eWAT 中的組織重量（圖1f）、OXPHOS 含量（擴展數據圖3o,p）和粒線體 OCR（圖3f）並未受到 RalA 刪除的影響，這與 RalA KO 在 HFD 小鼠中未逆轉該區域中碎裂粒線體的觀察結果一致（擴展數據圖5g）。實際上，eWAT 中的粒線體在 HFD 反應中未經歷顯著的碎裂，可能是因為它們已經呈現碎裂形狀，這與內臟脂肪細胞的整體合成功能一致（圖4d，擴展數據圖5g）。我們還檢查了來自 iWAT 分化的不朽化脂肪細胞中的粒線體形態。如圖4e所示，KO 脂肪細胞中的粒線體比 WT 細胞中的粒線體更長。KO 細胞中較長粒線體（1.0-1.5 μm）的頻率更高（圖4f），而平均最大粒線體長度顯著高於 WT 細胞（圖4g）。

抑制 RalA 增加白色脂肪細胞中 Drp1 S637 的磷酸化

Opa1 和 Drp1 已被確定為分別調控粒線體融合和分裂的關鍵因子。Opa1 經蛋白酶切割生成長（L-Opa1）和短（S-Opa1）兩種形式，共同推動粒線體融合。HFD 餵食後，iWAT 中這兩種形式的 Opa1 蛋白水平均下調（擴展數據圖5h-j）；而在 RalaAKO 小鼠的 eWAT 中僅 S-Opa1 下調（擴展數據圖5k-m），表明與 WT 同窩小鼠相比，KO 小鼠的融合可能減少。然而，KO 小鼠中觀察到的粒線體延長（圖4d）表明 Opa1 處理的這一變化可能是補償性的。我們接著關注作為分裂關鍵調控因子的 Drp1。有趣的是，在 Rala-KO iWAT 中，Drp1 反分裂 S637 位點的磷酸化顯著增加（圖5a，擴展數據圖6a），而 eWAT 中基因型之間的 Drp1 S637 磷酸化相當（擴展數據圖6b,c）。為了確立這一效應是否是細胞自主的，我們檢查了不朽化和初級脂肪細胞中的 Drp1 磷酸化。Drp1 S637 磷酸化由 PKA 催化，後者由 β-腎上腺素能/cAMP 路徑激活。CL 在脂肪細胞中刺激 Drp1 S637 磷酸化，5 分鐘後觸發，15 分鐘達到最大值（圖5b，擴展數據圖6d）。與體內結果一致，Rala-KO 脂肪細胞在 β-腎上腺素刺激後顯示顯著更高的 Drp1 S637 磷酸化（圖5c，擴展數據圖6e）。我們還使用特定的 Ral 抑制劑探討了 RalA 對 Drp1 S637 磷酸化狀態的影響，該抑制劑可防止激活並使 GTPase 保持在 GDP 结合的失活狀態。用全 Ral 抑制劑 RBC8 預處理顯著增加了 forskolin 刺激的 3T3-L1 脂肪細胞中的 Drp1 S637 磷酸化（擴展數據圖6f,g）。抑制 RalA 活性也增加了 forskolin 刺激的人初級脂肪細胞系（SGBS）中的 Drp1 S637 磷酸化（圖5d,e）。因此，RalA 在 PKA 激活後調控多種小鼠和人脂肪細胞系中的 Drp1 S637 磷酸化。為了確定 RalA 是否影響 CL 誘導的 PKA 激活或 cAMP 分解，我們測量了脂肪細胞中的 cAMP 生成和激素敏感性脂肪酶（HSL）的磷酸化。CL 刺激 5 分鐘後，WT 和 KO 初級脂肪細胞之間的 cAMP 生成沒有差異（擴展數據圖6h）。同樣，WT 和 KO 脂肪細胞中的 HSL S660 磷酸化也相同（擴展數據圖6i-l）。

圖5 抑制 RalA 增加白色脂肪細胞中 Drp1 S637 的磷酸化。

為了檢驗 Drp1 作為人類肥胖代謝調控因子的相關性，我們分析了肥胖和非肥胖女性腹部皮下 WAT 的微陣列數據。在人類皮下 WAT 中，DNM1L（編碼人類 Drp1 蛋白）的表達與 BMI 和 HOMA 正相關（圖5f,g），且在肥胖受試者中其表達顯著上調（圖5h），這表明 DNM1L 表達增加可能促進肥胖中的粒線體功能障礙。此外，對770名男性的已發表微陣列數據（GEO: GSE7053）的生物信息學分析進一步證實了 DNML1 與肥胖的相關性（擴展數據圖6m-o）。綜合這些體內和體外數據表明，脂肪組織中 Drp1 活性上調可能是肥胖期間粒線體功能障礙的重要因素，並且 RalA 缺失通過增加 Drp1 S637 的磷酸化保護粒線體免受過度分裂。

RalA 與 Drp1 和蛋白磷酸酶 2A 互作，促進 Drp1 在 S637 位點的去磷酸化

為了解 RalA 調控 Drp1 S637 磷酸化的分子機制，我們使用蛋白質組學搜索異位表達於肝臟的野生型（WT）、構成性活性（G23V）或顯性負（S28N）形式的 RalA 互作蛋白。在結合蛋白中有蛋白磷酸酶 2A 亞基 A alpha（PP2Aa），這是由 Ppp2r1a 基因編碼的支架亞基，該亞基優先與 RalAG23V 構成性活性突變體結合。為了確認這些質譜數據，我們從 HEK293T 細胞中純化 RalAWT-Flag 蛋白，並從裂解物中拉下 PP2Aa（圖6a）。為了確定這種互作是否依賴於 G 蛋白的活化狀態，我們在 HEK293T 細胞中共表達 WT 和突變 RalA 構建體與 PP2Aa。作為陽性對照，效應子 Sec5 只與活性 RalAG23V 結合。同樣，這種 RalA 突變形式對 PP2Aa 具有最高的親和力（圖6b）。我們還在體外用 GTPγS 或 GDP 加載 RalA-Flag 融合蛋白，以評估效應子結合的特異性。Sec5 和 PP2Aa 都被 GTPγS 加載的 RalA 拉下，而不是 GDP（圖6c）。此外，由於 PP2Aa 和 Drp1 未獨立互作（數據未顯示），我們研究了 RalA 是否通過 PP2Aa 直接修飾 Drp1 磷酸化。當共表達時，Drp1 和 RalA 直接互作，雖然對 RalA 的活化狀態沒有偏好（擴展數據圖7a）。通過添加 forskolin 激活 cAMP/PKA 軸增加 Drp1 S637 磷酸化，而共表達 PP2Aa 促進 S637 的去磷酸化（圖6d），雖然過度表達 PP2Ab 沒有影響（擴展數據圖7b）。這些數據表明，Drp1 與 RalA 構成性關聯，無論活化狀態，並且在活化後，RalA 招募 PP2Aa 以促進 Drp1 S637 的去磷酸化。

圖6 RalA 與 Drp1 和蛋白磷酸酶 2A 互作，促進 Drp1 在 S637 位點的去磷酸化。

為了進一步了解 RalA 活化狀態對 Drp1 磷酸化和粒線體功能的影響，我們在分化為脂肪細胞之前，用 RalAWT 和 RalAG23V 慢病毒轉導不朽化的 RalA KO 細胞。表達 RalAG23V 的脂肪細胞顯示出 RalA GTP 結合的顯著增加（圖6e），且這些細胞的 Drp1 S637 磷酸化顯著減少（圖6f，擴展數據圖7c）。表達 RalAWT 或 RalAG23V 顯著降低了 KO 脂肪細胞的粒線體膜電位（圖6g，擴展數據圖7d）。為了確認這種粒線體膜電位的降低與氧化功能的減少相關，我們進行了海馬測試。與初級脂肪細胞中的結果一致，表達 RalAWT 和 RalAG23V 的脂肪細胞顯示出較低的基礎和最大氧氣消耗率（OCR），與 KO 脂肪細胞相比（圖6h，擴展數據圖7e）。此外，電子顯微鏡顯示，脂肪細胞中 WT 或構成性活性 RalA 的過度表達導致粒線體碎裂，表明與 RalA KO 脂肪細胞相比，分裂增加（圖6i）。

此前有報導稱，RalA 促進增殖細胞中的分裂，Rala 敲低導致粒線體網絡延長和相互連接，並減少增殖。部分與此研究一致，我們發現 RalA 缺失導致脂肪細胞中粒線體延長，氧化磷酸化增加，對全身脂質代謝產生顯著影響。然而，不同於先前的研究，我們沒有觀察到 RalBPI 與 Drp1 之間的互作。有趣的是，與對照組 iWAT 相比，Rala KO iWAT 中總 PP2Aa 蛋白水平增加，而 PP2Ab 和 PP2Ac 含量沒有差異（擴展數據圖7f,g），這可能反映了一種補償性途徑。綜合來看，我們的數據表明，肥胖驅動 RalA 表達和 GTP 結合活性，導致其與 PP2Aa 的結合，進而招募催化亞基 PP2Ac 去磷酸化 Drp1 S637。我們還注意到，肥胖狀態固有的兒茶酚胺抗性預期會導致 PKA 催化的 S637 磷酸化減少。這些效應共同導致肥胖受試者脂肪細胞中 Drp1 的構成性粒線體易位和粒線體碎裂（擴展數據圖8）。

討論

雖然越來越多的證據表明，粒線體功能障礙是人類和鼠類脂肪細胞肥胖的特徵，但其潛在的分子機制仍然未知。在這裡，我們報告了一個新的調控軸，通過小GTP酶RalA的持續激活來控制肥胖背景下的粒線體形態和功能。我們顯示，高脂飲食（HFD）後，RalA在白色脂肪細胞中被誘導和激活，而RalA的負調控因子RalGAP則下調。我們還觀察到在人類肥胖者的脂肪組織中，RalGEF RGL2的表達與BMI正相關，這預示著RalA活性的慢性增加。脂肪細胞中RalA mRNA、蛋白質和活性的增加與粒線體功能障礙相關，具體表現為iWAT中的粒線體碎裂和氧化能力降低。針對性刪除白色脂肪細胞中的RalA可以防止肥胖依賴的粒線體碎裂，並通過增加能量消耗使小鼠對HFD誘導的體重增加具有抵抗力。體外研究顯示，RalA通過逆轉粒線體分裂蛋白Drp1的抑制性磷酸化來增加分裂，從而抑制脂肪細胞的粒線體氧化功能。這種磷酸化的減少是由於招募了PP2A的調節亞基，該亞基作為RalA的真正效應子，導致Drp1上抑制性Ser637殘基的特異性去磷酸化，使該蛋白活化。我們還注意到我們之前的研究，通過脂肪細胞特異性刪除Ralgapb使RalA構成性激活，導致白色脂肪細胞顯著增大和脂肪組織質量增加，即使在控制飲食下也是如此。因此，RalA活性的慢性升高在抑制肥胖脂肪組織的能量消耗方面起著關鍵作用，促進體重增加和相關的代謝功能障礙，包括葡萄糖不耐受和脂肪肝，並可能部分解釋了在長期肥胖中能量消耗被抑制的原因。

觀察到脂肪細胞RalA通過這一機制控制整體系統代謝是令人驚訝的。我們和其他人之前報告稱，RalA在控制脂肪細胞和肌肉中GLUT4小泡運輸方面起著關鍵作用。RalA由胰島素激活，主要通過磷酸化抑制其GAP複合物，當激活時，RalA與外泌體複合物的組分互作，將GLUT4小泡靶向至細胞膜進行融合，增加葡萄糖進入脂肪細胞。事實上，用RalA抑制劑處理的脂肪細胞或來自RalA KO小鼠的脂肪細胞顯示，GLUT4轉運至細胞膜顯著減少，胰島素刺激下的葡萄糖攝取減少。靶向刪除RalGAP複合物的支架亞基導致脂肪細胞和肌肉細胞中RalA構成性激活，顯著改善葡萄糖穩態。然而，詳細的生理示蹤劑研究表明，脂肪細胞特異性KO小鼠的葡萄糖處理改善主要發生在棕色脂肪中，該處的葡萄糖攝取顯著增加。與這些發現一致，我們觀察到RalaAKO小鼠在控制飲食下胰島素敏感性略有降低，伴隨所有脂肪組織重量減少，這可能反映了營養物攝取減少。然而，HFD上的RalaAKO小鼠矛盾地顯示出改善的葡萄糖耐受性和胰島素敏感性。雖然目前尚不清楚這些小鼠如何克服RalA刪除對葡萄糖攝取的負面影響，但在肥胖中WAT中的GLUT4 mRNA和蛋白水平下調，GLUT1 mRNA和蛋白水平增加，這與我們在HFD餵養的小鼠中進行的RalGAP KO研究一致，顯示白色脂肪對胰島素的葡萄糖攝取較少，但基礎水平較高。因此，RalaAKO小鼠的葡萄糖耐受性改善可能是由於體重減輕和能量消耗增加。

同樣有趣的是，HFD上的RalaAKO小鼠的肝功能顯著改善，肝臟脂質和糖異生減少，這表明丙酮酸耐受性改善。眾所周知，WAT在調節全身能量代謝中起著重要作用。肝臟乙酰輔酶A來自WAT的脂解，直接促進肝臟糖異生。Rala-KO脂肪細胞中脂肪酸氧化的增加導致循環FFA和TG減少，可能改善肝臟健康並減少糖異生。

雖然RalA作用的脂肪存儲區特異性的意義尚不確定，但我們注意到內臟、皮下和棕色脂肪中的脂肪細胞在許多方面有所不同。雖然在RalaAKO小鼠中所有脂肪細胞中均刪除了RalA，但僅iWAT的粒線體功能改善。內臟和腹股溝白色脂肪細胞之間有許多差異可能解釋這一現象，包括它們對HFD的反應，一個值得注意的問題是固有的粒線體形態。在HFD餵養時，iWAT中的脂肪細胞經歷了顯著的尺寸擴大，伴隨著粒線體形態從延長到碎裂的變化，反映出主要為合成狀態的轉變。這些變化在RalA KO小鼠中未觀察到。與iWAT中的觀察結果不同，eWAT中的粒線體即使在瘦小鼠中也顯示出碎裂的形態，HFD或RalA KO後沒有變化，這與該存儲區在沒有營養過剩壓力下的整體能量儲存功能一致。

另一個問題是RalA在BAT中的作用。與對照組相比，RalaAKO和RalaBKO小鼠的BAT組織重量減少，這可能是由於葡萄糖攝取減少，但只有iWAT脂肪細胞對代謝活性和粒線體形態的變化作出反應。棕色脂肪細胞粒線體在形態上與白色脂肪細胞中的粒線體不同。這些棕色脂肪細胞粒線體比白色脂肪細胞中的粒線體更大且更為多數，並且含有緊密排列的嵴。比較棕色和白色脂肪細胞的粒線體蛋白質組分析顯示，與白色脂肪相比，棕色脂肪中與脂肪酸代謝、OXPHOS和TCA循環相關的蛋白質高度表達。因此，似乎棕色脂肪中的粒線體受到的調控模式與白色脂肪有根本的不同，KO小鼠中BAT重量減少可以歸因於葡萄糖攝取減少。

由於粒線體功能對健康代謝至關重要，努力的重點在於通過阻斷Drp1的活性或直接刪除Drp1來防止碎裂。肌肉粒線體功能障礙與過度Drp1活性密切相關，在嚴重肥胖的人類肌肉中發現了升高的Drp1激活S616磷酸化。另一方面，觸發Drp1 S637磷酸化被認為可以增加棕色脂肪細胞中FFA的解偶聯能力。與此觀察一致，在冷暴露後的BAT中發現了S637磷酸化的增加。Drp1抑制劑的給予可急性改善肌肉胰島素敏感性和系統性葡萄糖耐受性。然而，調節Drp1水平的影響是複雜的，在不同組織之間有所不同。在NAFLD模型中，靶向刪除肝臟中的Drp1減少了肝臟脂質積累和體重。此外，Drp1的缺失會損害棕色脂肪細胞的分化和產熱，這可能反映了粒線體形態中獨特於BAT的方面。有趣的是，在這些特定組織的Drp1敲除小鼠模型中觀察到ER壓力，這表明Drp1也可能調節ER重塑。這些發現強調了Drp1活性完全缺失和其上游調控途徑變化之間的差異。

許多問題仍然存在，涉及RalA/Drp1軸在皮下脂肪細胞中控制粒線體功能的角色。在肥胖期間，RalA mRNA和蛋白質表達增加以及RalGAP減少的機制是什麼？此外，導致RalA GTP結合增加的因素尚不清楚，這可能是由於RalGAP表達減少以及肥胖中觀察到的高胰島素血症和Akt活性慢性升高所致。一個關鍵問題是RalA活化和Drp1磷酸化/去磷酸化在脂肪細胞中的空間區隔化。是否存在不同細胞區隔中的RalA池與不同的效應子互作？RalA的其他亞型（RalB）是否也控制Drp1的定位和功能？與RalA互作的PP2Aa的作用域是什麼？雖然仍有許多問題需要解答，但這些發現為研究RalA/Drp1軸如何調節能量穩態開啟了一條新思路。

方法

動物
將 RalA-floxed (Ralaf/f) 小鼠與脂聯素啟動子驅動的 Cre 或 Ucp1 啟動子驅動的 Cre 轉基因小鼠交配，生成脂肪儲存特異性 RalA 基因剔除 (RalaAKO 或 RalaBKO) 小鼠。所有小鼠均具有 C57BL/6J 背景，所有實驗均使用同窩小鼠進行。雄性小鼠用於體內實驗，雌性小鼠僅用於初級前脂肪細胞分離。我們餵養小鼠標準飼料 (CD) (Teklad, #7912) 或含 60% 脂肪的高脂肪飲食 (HFD) (Research Diets, #D12492) 持續 8-12 週，從 8 週齡開始。小鼠被安置在特定病原體無菌設施中，12 小時光照和 12 小時黑暗周期，自由進食和飲水。所有動物實驗均由加州大學聖地亞哥分校動物照護與使用委員會 (IACUC) 批准並遵循其指南。

初級前脂肪細胞
初級前脂肪細胞的分離參照之前的方法67進行，並進行了一些修改。從兩到三隻 8 週齡的雌性小鼠中解剖出 IWAT，切碎並在 37°C 水浴中以 1 mg/mL 膠原酶 (Sigma) 5 mL 消化 15 分鐘，並輕輕攪拌。加入含有 10% 胎牛血清 (FBS) 的 DMEM/F12 培養基 (15 mM HEPES) 以停止消化，並通過 100 μm 和 70 μm 篩網過濾。離心後，將細胞接種到一個 10 cm 培養皿中，並在 DMEM/F12-FBS 培養基中培養。分離後 3 天，細胞用 DPBS 洗滌三次以去除死細胞，並在新鮮的 DMEM/F12-FBS 培養基中培養。當細胞達到 90% 匍匐生長時，將前脂肪細胞接種到 12 孔板或成像皿中進行分化。初級前脂肪細胞的分化參照其他文獻68。

永生化脂肪細胞
來自 Ralaf/f 小鼠的初級前脂肪細胞經逆轉錄病毒轉導 pBabe-zeo-LT-ST(SV40) 永生化，並用 Zeocin 選擇69。選擇單細胞克隆並測試其分化能力。本研究中使用的所有克隆在分化後均顯示出 100% 的脂肪細胞形態。為了生成 Rala 基因剔除 (KO) 細胞，將永生化的 Ralaf/f (WT) 前脂肪細胞用含有 8 μg/mL polybrene 的慢病毒 Ore 感染 12 小時，然後在 DMEM/F12-FBS 培養基中培養。在前脂肪細胞和脂肪細胞中測試 Cre 重組酶的效率。當達到 95-100% 匍匐生長 (第 0 天) 時，將永生化前脂肪細胞在含有 0.5 μM IBMX、5 μM 地塞米松、1 μM 羅格列酮和 5 μg/mL 胰島素的 DMEM/F12-FBS 培養基中誘導 3 天。然後將培養基改為含有羅格列酮和胰島素的 DMEM/F12-FBS 培養基。第 5 天，將細胞改為僅含胰島素的 DMEM/F12-FBS 培養基。第 7 天，細胞保持在 DMEM/F12-FBS 培養基中直到 100% 分化。在實驗當天，細胞在 DMEM/F12 培養基中飢餓 3 小時，然後添加處理劑。

人類初級前脂肪細胞 (SGBS)
人類 SGBS 細胞按之前的方法70培養，並按發表的協議71進行分化。

3T3-L1 脂肪細胞
小鼠 3T3-L1 成纖維細胞在含有 10% 新生牛血清 (NBCS) 的高葡萄糖杜氏改良鷹培養基 (DMEM) 中培養。達到 100% 匍匐生長 2 天後，將細胞在含有 10% FBS 的 DMEM (DMEM-FBS) 培養基中誘導分化，該培養基中含有 0.5 mM IBMX、1.25 μM 地塞米松和 2 μg/mL 胰島素，培養 3 天。之後，將細胞在含有 2 μg/mL 胰島素的 DMEM-FBS 培養基中再培養 2 天。48 小時後，細胞在 DMEM-FBS 培養基中培養至完全分化。僅使用超過 95% 細胞顯示脂肪細胞形態的培養物進行實驗。

HEK 293T 細胞
HEK 293T 細胞在高葡萄糖 DMEM-FBS 培養基中培養。在接種的同一天，當細胞達到 50% 匍匐生長時，使用 lipofectamine 2000 (Life Technology) 按照製造商的協議進行轉染。轉染後 12-16 小時添加新鮮的 DMEM-FBS 培養基。轉染後 48 小時，細胞達到約 80% 匍匐生長，並用於免疫共沉澱或拉下實驗。

Lenti-X 293T 細胞
Lenti-X 293T 細胞在高葡萄糖 DMEM-FBS 培養基中培養以包裝慢病毒。當細胞在 0.01% 聚賴氨酸塗覆的培養皿中達到 100% 匍匐生長時，將第 3 代慢病毒包裝質粒 (pLVX 向量、pMDLg/pRRE (Addgene#12251)、pRSV-Rev (Addgene#12253) 和 pMD2.G (Addgene#12259)) 使用 lipofectamine 3000 (Life Technology) 按照製造商的協議轉染到細胞中。轉染後 12-16 小時，添加含有 25 mM HEPES 的新鮮 DMEM-FBS 培養基。轉染後 48 和 72 小時收集兩次含有慢病毒的培養基。收集後，培養基以 1,200 x rpm 離心 5 分鐘以去除死細胞，然後在 4°C 下以 3:1 的比例與 Lenti-X 濃縮劑 (Takara) 共同孵育過夜。病毒顆粒在 4°C 下以 1,500 x g 離心 45 分鐘後收集，重懸於含 8 μg/mL polybrene 的 DMEM/F12-FBS 培養基中。重懸後立即將慢病毒添加到細胞中。

RalA WT 和 RalA G23V 在 RalA KO 前脂肪細胞中的重構
將永生化 RalA KO 前脂肪細胞用濃縮的 Flag-RalA WT 或 Flag-RalA G23V 慢病毒上清液與 8 μg/mL polybrene 感染。感染 24 小時後，將培養基更換為新鮮的 DMEM/F12-FBS 並擴增至分化。通過西方墨點法檢查完全分化細胞中 Flag 標記蛋白的表達。

腹部皮下脂肪組織的轉錄組學數據來自 30 位肥胖女性和 26 位健康非肥胖女性，數據生成參考之前的方法72。轉錄組譜使用 GeneChip Human Gene 1.0 ST Arrays 獲得。數據已存放於 NCBI 基因表達綜合數據庫 (GEO)，登錄號為 GSE25402。驗證隊列中的轉錄組譜來自參加 METSIM 研究的 770 名男性的皮下脂肪活檢73。轉錄組學和臨床數據從 GEO (GSE70353) 獲取。分析中，BMI 超過 30 kg/m2 的人被視為肥胖。

將切碎的白色脂肪組織在 37°C 下用含有 1 mg/mL 膠原酶 (Sigma) 的 DMEM 消化 25 分鐘，並輕輕攪拌。細胞懸液通過 100 μm 細胞篩網過濾，並以 50 x g 離心 3 分鐘分離浮動的成熟脂肪細胞。將浮動的成熟脂肪細胞轉移到含有寬口吸頭的 PBS 中，並洗滌兩次。將 1 mL 成熟脂肪細胞溶解在 4 mL TRIzol™ (Life Technology) 中以分離 RNA。

使用 TRIzol™ (Life technologies) 和 PureLink RNA mini kit (Life technologies) 提取初級成熟腹股溝和附睾脂肪細胞中的 RNA，按照製造商的說明進行操作。使用 Agilent TapeStation 檢查 RNA 質量。將分離的 500 ng RNA 的生物學三重複用於使用 TruSeq RNA Sample Preparation Kit v2 (Illumina) 準備測序庫，按照製造商的協議進行。使用 2100 BioAnalyzer (Agilent) 驗證庫，然後標準化並使用帶條碼的多重測序在 Illumina HiSeq 4000 上以 90-bp 單端讀取長度進行測序。樣本的測序深度中位數為 1400 萬讀數。

對於 RNA-Seq，使用 Illumina bcl2fastq2 轉換軟體自動生成測序 fastq 文件。讀取比對和基因組 mm39 (GRCm39) 和小鼠 Genecode M30 註釋的結合映射使用 STAR (版本 2.7.2b) 完成。已知的 mm10 剪接結合點提供給比對工具，並允許新的結合點發現。使用 DESeq2 進行差異基因表達分析和統計檢驗。差異表達的基因被定義為調整後 P 值 < 0.05。使用 DESeq2 將原始基因計數標準化為 FPM (每百萬個比對片段)。將 FPM 計數過濾後，通過 z-score 居中後使用 GENE-E (v3.0.215) 或 GraphPad Prism (8.4.3) 進行基因聚類和熱圖生成。對於微陣列數據，使用 GSEA (4.3.2) 中的 Collapse Dataset 工具按芯片平台 (GPL13667) 和崩潰模式 (Mean_of_probes) 進行基因矩陣文件的崩潰。使用 GenePattern (https://cloud.genepattern.org/gp/pages/index.jsf) 中的 ComparativeMarkerSelection 模塊 (版本 11) 評估差異基因表達的統計顯著性。

根據製造商的協議，使用 TRIzol™ 試劑結合柱 (PureLink RNA mini, Invitrogen) 分離組織 RNA。使用 cDNA Maxima Reverse Transcription Kit (Thermo Fisher Scientific) 從 1 μg RNA 生成 cDNA。使用 QuantStudio 5 實時 PCR 系統和 SYBR Green PCR master mix (Invitrogen) 進行實時 PCR 以評估 mRNA 表達。在小鼠組織中，基因表達標準化為 Cyclophilin A。相對 mRNA 表達水平使用每個生物複製的平均 2−ΔΔCt 值計算。引物列在擴展數據表 1 中。

組織或細胞在新鮮添加的 Halt™ 蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物 (ThermoFisher) 的 RIPA 緩衝液中裂解或均質化。裂解物在冷室中旋轉 30 分鐘，然後短暫超聲波處理，並以 17,000 x g 離心 15 分鐘，4°C。收集澄清的上清液，並使用 BCA 蛋白質測定試劑盒 (Pierce) 進行定量。蛋白質通過 Tris-Glycine 凝膠 (Novex, Invitrogen) 電泳分離並轉移到硝酸纖維素膜上。使用特定抗體 (OXPHOS ab110413、β-Tubulin 2146S、phospho-Drp1 (Ser637) 4867S、phospho-HSL (Ser660) 45804S、HSL 4107S、MYC 2276S、Drp1 8570S、phospho-AMPK (Thr172) 2535S、AMPK 5831S、RalA BD610221、β-Actin 66009-1-Ig、FLAG 66008-4-Ig、GFP 66002-1-Ig、Sec5 12751-1-AP) 檢測個別蛋白質，並使用螢光二抗 (mouse 926-32210、rabbit 926-68071) 和 Li-Cor 系統或使用過氧化物酶偶聯二抗 (Fisher Scientific) 和 SuperSignal West Pico 化學發光底物 (ThermoFisher) 在薄膜上顯影。使用 ImageStudio 或 ImageJ 進行帶的定量。

使用 EchoMRI 評估未麻醉小鼠的體重組成。

小鼠禁食 6 小時，然後在腹腔內 (i.p.) 注射 D-[+]-葡萄糖 (2 g/kg BW) 給予 CD 飼養的小鼠，或 1.2 g/kg BW 給予 HFD 飼養的小鼠。在注射前及注射後 15、30、60、90 和 120 分鐘使用 Easy Touch 血糖監測系統測量血糖水平。

小鼠禁食 4 小時，然後在腹腔內注射人胰島素 (Sigma) (0.35 U/kg BW) 給予 CD 飼養的小鼠，或 0.6 U/kg BW 給予 HFD 飼養的小鼠。在注射前及注射後 15、30、60、90 和 120 分鐘使用 Easy Touch 血糖監測系統測量血糖水平。

小鼠禁食 16 小時，然後在腹腔內注射丙酮酸 (1.5 g/kg BW) 給予 HFD 飼養的小鼠。在注射前及注射後 15、30、60、90 和 120 分鐘使用 Easy Touch 血糖監測系統測量血糖水平。

從面靜脈採集全血，並用血糖儀 (Easy Touch) 測量尾靜脈的血糖。血漿經 1,200 x rpm 離心 10 分鐘 (4°C) 後收集。使用 Infinity™ Triglycerides 試劑盒 (Thermo Fisher) 和 NEFA 試劑盒 (WAKO) 測量血漿甘油三酯 (TG) 和遊離脂肪酸 (FFA) 水平。使用 Mouse Ultrasensitive Insulin ELISA 試劑盒 (Crystal Chem, #90080) 測量血漿胰島素水平，並使用 Mouse Leptin ELISA 試劑盒 (Crystal Chem, #90030) 測量瘦素水平。使用天冬氨酸轉氨酶活性試劑盒 (Biovision, #K753) 和丙氨酸轉氨酶活性試劑盒 (Biovision, #K752) 測量血漿 AST 和 ALT 活性。

胰島素抵抗穩態模型評估 (HOMA-IR) 是整體胰島素敏感性的指標74。測量過夜禁食小鼠的葡萄糖和胰島素水平，並使用公式計算 HOMA-IR：空腹胰島素 (μU/L) x 空腹葡萄糖 (nmol/L) / 22.5。

將冷凍肝組織 (50-100 mg) 均質化於 1 mL PBS 中。將 800 μL 裂解物加入 4 mL 提取緩衝液中，在室溫下充分旋轉 30 分鐘。通過 3,000 x rpm 離心 20 分鐘分離脂質相和水相。收集 0.2 mL 有機相中的脂質部分，轉移至 1.5 mL 管中，在通風櫃中氮氣流下干燥。使用 0.2 mL 2% Triton X-100 溶液溶解脂質。使用 Infinity™ Triglycerides 試劑盒 (Thermo Fisher) 測定甘油三酯水平。脂質量標準化為肝裂解物蛋白質量。

對於 H&E 染色，收集肝組織並固定於 10% 甲醛中。石蠟包埋、切片和蘇木精 & 伊紅 (H&E) 染色在 UC San Diego 生物儲存和組織技術共享資源 (BTTSR) 完成。對於脂肪細胞大小定量，使用 Keyance 明場顯微鏡或 Nikon 共聚焦顯微鏡與 Texas Red 激發和發射濾光片成像 H&E 切片。使用 Image J 中的 Adiposoft 和根據之前描述的 Cell Profiler 內部開發的管道測定脂肪細胞大小。對於 Oil-Red-O 染色，將肝組織固定於 4% PFA 中 (4°C，24 小時)，然後轉移至 20% 蔗糖/PBS 中 24 小時。之後，組織在干冰和乙醇中用 O.C.T. (Sakura) 包埋。冷凍組織塊在 UCSD 的 BTTSR 切片並進行 Oil-Red-O 染色。

對於代謝籠研究，小鼠單獨飼養於 Promethion 代謝籠中，在 22°C 下保持 12 小時光照/12 小時黑暗周期。在實驗前，小鼠適應代謝籠 2 天。監測系統記錄和計算食物攝取量、運動活動、氧氣消耗量、二氧化碳產生量、呼吸交換比率 (RER) 和能量消耗 (EE)。測量期間小鼠自由進食和飲水。數據使用 ExpeData 軟件 (SABLE SYSTEMS) 導出，並使用 ANCOVA 進行 EE 分析，體重作為協變量，通過基於網絡的 CaIR 工具75。

完整細胞
使用 eXF96 細胞外通量分析儀測量細胞 OCR，並使用 Agilent Seahorse Wave 軟件 (Seahorse Bioscience) 分析。在測定前，將 2,500 個初級前脂肪細胞接種到 XF96 微孔板中。達到完全匍匐生長兩天後，使用上述方案進行脂肪生成分化。完全分化後，將脂肪細胞培養基更換為含有 25 mM 葡萄糖、1 mM 丙酮酸、2 mM L-谷氨酰胺和 0.5 mM 肉鹼的不含酚紅或碳酸氫鈉的測定培養基，培養 3 小時。在測量前，細胞在無二氧化碳培養箱中孵育 15 分鐘。測定基礎呼吸率並依次注射奧利格黴素 (2 μM)、FCCP (0.5 μM) 和魚藤酮與抗黴素 A (各 0.5 μM)。氧氣消耗值標準化為蛋白質含量。
分離的線粒體
從 HFD 飼養的小鼠分離線粒體，並按照之前描述的方法進行 2.5 μg 分離線粒體的 OCR 測量30。

脂肪酸氧化 (FAO) 測試根據之前描述的方法76進行修改。完全分化的初級脂肪細胞在 24 孔板中每孔用 0.5 mL DMEM 培養，其中含有 1 mM 肉鹼和 0.5 μCi/孔 [14C]-棕櫚酸，在 37°C 下孵育 60 分鐘。之後，收集 360 μL 培養基，加入到 1.5 mL 管中含有 10% BSA 的 40 μL 中，蓋子中放置濾紙。加入 200 μL 1 M 高氯酸，立即緊閉蓋子，室溫孵育 1 小時。捕獲的 CO2 和酸溶性代謝物 (ASM) 用於測量放射性。細胞在 NaOH/SDS 緩衝液 (0.3 N/0.1%) 中裂解以測量蛋白質濃度。FAO 速率標準化為蛋白質含量。

活細胞
將完全分化的脂肪細胞培養在玻璃底培養皿 (Cellvis) 中，並在不含酚紅的 DMEM (成像培養基) 中加入 100 nM TMRM (Thermo Fisher) 孵育 30 分鐘，以顯示線粒體膜電位。最後 15 分鐘加入 BODIPY 493/503 (最終濃度 5 μg/mL, Life Technology) 標記脂滴。然後用成像培養基洗滌三次。使用 Nikon A1R 共聚焦顯微鏡和 100 倍或 60 倍油浸物鏡獲取活細胞圖像。對於延時成像，每 10 分鐘拍攝一次照片。

固定細胞
將完全分化的初級脂肪細胞培養在玻璃底腔室 (Lab-Tek) 中。實驗當天，細胞在血清饑餓 3 小時並用 100 nM 胰島素處理。15 分鐘後，去除培養基，並用冰冷的甲醇固定細胞，在 −20°C 下孵育 10 分鐘。然後用 PBS 洗滌兩次，並在室溫下用含有 0.1% Triton X-100 的 10% 山羊血清在 PBS 中封閉 30 分鐘。封閉後，細胞在 4°C 下過夜孵育一抗，然後在室溫下孵育二抗 1 小時。用 PBS 洗滌三次後，使用 Nikon A1R 共聚焦顯微鏡和 100 倍油浸物鏡進行成像。

體外
在 24 孔板中完全分化的初級脂肪細胞在脂解培養基 (2% BSA-不含酚紅 DMEM) 中饑餓 3 小時。對於胰島素處理，饑餓 2.5 小時後，向細胞中加入 100 nM 胰島素 30 分鐘。饑餓後，用含有溶劑、1 μM CL、100 nM 胰島素或其組合的 0.5 mL 新鮮脂解培養基替換培養基。37°C 孵育 1 小時後收集培養基。釋放的游離脂肪酸和游離甘油水平使用 NEFA 試劑盒 (WAKO) 和游離甘油試劑 (Sigma) 根據製造商的協議測量 100 μL 培養基。

體內
使用 CD 飼養的小鼠進行體內脂解。對於 CL 誘導的脂解，隨意餵養的小鼠在腹腔內 (i.p.) 注射 PBS 或 CL (1 mg/kg) 60 分鐘。使用 2 μL 血漿和 NEFA 試劑盒 (WAKO) 及游離甘油試劑 (Sigma) 測量循環中的游離脂肪酸和游離甘油水平。對於胰島素抑制的脂解，過夜禁食的小鼠在腹腔內注射胰島素 (0.5 U/kg) 60 分鐘。在指定條件下測量循環中的游離脂肪酸和游離甘油水平。

脂肪組織
解剖後的脂肪組織立即用 2-3 滴固定緩衝液 (2% 多聚甲醛、2.5% 戊二醛於 0.15 M cacodylate 鈉緩衝液，pH 7.4) 固定。脂肪組織在室溫下輕輕去除並固定。經過 2 小時的孵育後，將組織進一步切成約 1 mm³ 的立方體，並在 4°C 下浸泡在固定緩衝液中過夜。組織塊在冰上用 1% 鋨酸 0.15 M cacodylate 鈉緩衝液 (SC 緩衝液) 後固定 1-2 小時，然後在冰上用 0.15 M SC 緩衝液洗滌五次，每次 10 分鐘，再用 ddH₂O 沖洗。洗滌後的組織在 4°C 下用 2% 醋酸鈾染色 1-2 小時，然後在乙醇系列中脫水 (50%、70%、90%、100%、100%，每次 10 分鐘)，在室溫下用丙酮乾燥 15 分鐘。乾燥的組織在室溫下浸泡在 50%:50% 丙酮
中 1 小時或更長時間，然後換成 100% Durcupan 過夜。第二天，將嵌入 Durcupan 的組織置於 60°C 烤箱中 36 至 48 小時。用 Leica 超薄切片機和金剛石刀切割超薄切片 (60 nm)，然後用醋酸鈾和鉛後染。使用配備 Gatan 數位相機的 Jeol 1400 plus 傳輸電子顯微鏡獲取圖像。

永生化細胞
在 6 孔板中的完全分化細胞快速用含有 2% 戊二醛的 0.1 M cacodylate 鈉緩衝液 (pH 7.4) 在室溫下固定 15 分鐘，然後在 4°C 下孵育 15 分鐘。之後，將細胞刮下並通過離心沉澱。細胞沉澱在冰上用 1% OsO₄於 0.1 M cacodylate 鈉緩衝液中後固定 1 小時。細胞在冰上用 2% 醋酸鈾染色 1 小時，然後在梯度乙醇系列中脫水 (50-100%)，保持在冰上。細胞經過一次 100% 乙醇洗滌和兩次丙酮洗滌 (每次 10 分鐘)，並用 Durcupan 嵌入。使用 Leica UCT 超薄切片機切割 60 nm 的切片，並放置在 300 目銅網格上。切片用 2% 醋酸鈾後染 5 分鐘，用 Sato 的鉛染色 1 分鐘。使用配備 Gatan 數位相機的 Jeol 1400 plus 傳輸電子顯微鏡獲取圖像。

為了誘導 cAMP 產生，完全分化的初級脂肪細胞用 1 μM CL 刺激 5 分鐘。然後立即將細胞在裂解緩衝液 (0.1 N HCL) 中裂解，並根據製造商的協議使用直接 cAMP 酶免疫分析試劑盒 (Sigma) 測量 cAMP 水平。

活性 RalA 拉下
完全分化的初級脂肪細胞或永生化脂肪細胞在 DMEM 培養基中血清饑餓 3 小時，必要時用 100 nM 胰島素處理指定時間。用冰冷的 TBS 洗滌兩次後，細胞在 RalA 緩衝液 (25 mM Tris, 130 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10% 甘油, 0.5% NP-40, 無 EDTA 蛋白酶抑制劑) 中裂解，裂解物在 4°C 孵育 15 分鐘，然後通過離心清除。使用 DC 蛋白測定試劑盒 (Bio-Rad) 測量蛋白濃度，0.5–1 mg 蛋白在 4°C 與 20 μL GST−ΔRalBP1 琼脂珠 (Millipore) 孵育 45 分鐘或 20 μL ANTI-FLAG™ M2 親和凝膠 (Sigma) 過夜。孵育後，珠子用 RalA 緩衝液洗滌三次，並在 2X SDS 緩衝液中於 65°C 沸騰 10 分鐘。

拉下
在 15 cm 培養皿中培養的 HEK293T 細胞轉染 Flag-RalAWT 或 GFP-PP2Aa。轉染 48 小時後，細胞用冰冷的 TBS 洗滌兩次，然後在冰上用 1 mL 裂解緩衝液 (25 mM Tris-HCl, 130 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10% 甘油, 0.5% NP-40, 無 EDTA 蛋白酶抑制劑) 裂解。細胞裂解物在 4°C 旋轉 15 分鐘，然後在 17,000 x g 離心 15 分鐘清除。Flag-RalAWT 裂解物在 4°C 與 20 μL ANTI-FLAG™ M2 親和凝膠 (Sigma) 孵育。經過 2 小時旋轉，空 M2 或 Flag-RalAWT 珠子用裂解緩衝液洗滌三次，然後與 GFP-PP2Aa 裂解物在 4°C 孵育過夜。第二天，珠子用洗滌緩衝液 (25 mM Tris-HCl, 40 mM NaCl, 30 mM MgCl₂, 0.5% NP-40, 無 EDTA 蛋白酶抑制劑) 洗滌三次，並在 2X SDS 緩衝液中於 65°C 沸騰 10 分鐘。對於 GTPγS 和 GDP 加載到 Flag-RalAWT 珠子，洗滌後的珠子用加載緩衝液 (20 mM Tris, 50 mM NaCl, 1 mM DTT, 2 mM EDTA) 冲洗，然後在 25°C 下以 600 x rpm 攪拌孵育 1 小時與 2 mM GTPγS 或 200 μM GDP。加載後，添加 10 mM MgCl₂ 停止加載，並按照上述方法與 GFP-PP2Aa 裂解物孵育。

共免疫沉澱
共免疫沉澱實驗中，關鍵是收集約 70-80% 匍匐生長的細胞。共轉染細胞用冰冷的 TBS 洗滌兩次，並在 0.5 mL 裂解緩衝液 (與上述相同) 或 Drp1 緩衝液 (25 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.5 mM MgCl₂, 10% 甘油, 0.5% NP-40, 無 EDTA 蛋白酶抑制劑) 中裂解。裂解物通過離心清除，並使用 BCA (Pierce) 測量蛋白濃度。0.5-1 mg 蛋白在 4°C 與 20 μL ANTI-FLAG™ M2 親和凝膠 (Sigma) 孵育。經過過夜溫和旋轉後，珠子用洗滌緩衝液 (與上述相同) 或 Drp1 洗滌緩衝液 (25 mM Tris, 50 mM NaCl, 0.5 mM MgCl₂, 0.1% NP-40, 無 EDTA 蛋白酶抑制劑) 洗滌三次，並在 2X SDS 緩衝液中於 65°C 沸騰 10 分鐘。

pMIG-PP2Aa (#10884)、pMIG-PP2Ab (#13804) 和 pcDNA3.1-Drp1 (#34706) 質粒從 Addgene 購買並克隆到 mEGFP-C1 (#54759) 和 pCMV-Myc-3B 向量中。RalAWT、RalAG23V 和 RalAS28N 質粒被克隆到帶有 3x Flag 標籤的 pLVX 向量中用於慢病毒生產。

使用 GraphPad Prism (8.4.3) 進行統計分析。條形圖中的所有數據均以平均值 ± 標準誤 (SEM) 顯示。N 代表生物複製的數量。所有實驗至少獨立進行 3 次。兩組間的比較使用雙尾無配對學生 t 檢驗分析數據集。對於具有兩因素設計的實驗，通過雙向 ANOVA 分析多重比較，以確定基於一個變量的組間統計顯著性。使用 CaIR 和體重作為協變量，通過 ANCOVA 計算 EE 的差異。基因表達與 BMI 和 HOMA 值之間相關性的顯著性使用 Spearman 相關性檢驗計算。p < 0.05 的值被認為具有顯著差異。

參考文獻

Haththotuwa R.N., Wijeyaratne C.N., and Senarath U. (2020). Worldwide epidemic of obesity. Obes. Obstet., 3–8. 10.1016/B978-0-12-817921-5.00001-1. [CrossRef] [Google Scholar]2. Saltiel A.R. (2012). Insulin Resistance in the Defense against Obesity. Cell Metab. 15, 798–804. 10.1016/J.CMET.2012.03.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]3. Saltiel A.R., and Kahn C.R. (2001). Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid metabolism. Nat. 2001 4146865 414, 799–806. 10.1038/414799a. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]4. Kahn S.E., Hull R.L., and Utzschneider K.M. (2006). Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes. Nature 444, 840–846. 10.1038/NATURE05482. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]5. Reilly S.M., and Saltiel A.R. (2017). Adapting to obesity with adipose tissue inflammation. Nat. Rev. Endocrinol. 2017 1311 13, 633–643. 10.1038/nrendo.2017.90. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]6. Hotamisligil G.S. (2006). Inflammation and metabolic disorders. Nature 444, 860–867. 10.1038/NATURE05485. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]7. Kusminski C.M., and Scherer P.E. (2012). Mitochondrial dysfunction in white adipose tissue. Trends Endocrinol. Metab. 23, 435–443. 10.1016/J.TEM.2012.06.004. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]8. Rambold A.S., Cohen S., and Lippincott-Schwartz J. (2015). Fatty Acid Trafficking in Starved Cells: Regulation by Lipid Droplet Lipolysis, Autophagy, and Mitochondrial Fusion Dynamics. Dev. Cell 32, 678–692. 10.1016/J.DEVCEL.2015.01.029. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]9. Eun H.K., Park J.Y., Park H.S., Min J.J., Je W.R., Kim M., Sun Y.K., Kim M.S., Kim S.W., In S.P., et al. (2007). Essential Role of Mitochondrial Function in Adiponectin Synthesis in Adipocytes. Diabetes 56, 2973–2981. 10.2337/DB07-0510. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]10. Tormos K. V., Anso E., Hamanaka R.B., Eisenbart J., Joseph J., Kalyanaraman B., and Chandel N.S. (2011). Mitochondrial Complex III ROS Regulate Adipocyte Differentiation. Cell Metab. 14, 537–544. 10.1016/J.CMET.2011.08.007. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]11. Mayer J., Bates M.W., and Dickie M.M. (1951). Hereditary diabetes in genetically obese mice. Science 113, 746–747. 10.1126/SCIENCE.113.2948.746. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]12. Kahn B.B., and Flier J.S. (2000). Obesity and insulin resistance. J. Clin. Invest. 106, 473–481. 10.1172/JCI10842. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]13. Sebastián D., Hernández-Alvarez M.I., Segalés J., Sorianello E., Muñoz J.P., Sala D., Waget A., Liesa M., Paz J.C., Gopalacharyulu P., et al. (2012). Mitofusin 2 (Mfn2) links mitochondrial and endoplasmic reticulum function with insulin signaling and is essential for normal glucose homeostasis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 5523–5528. 10.1073/PNAS.1108220109/SUPPL_FILE/PNAS.201108220SI.PDF. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]14. Kelley D.E., He J., Menshikova E. V., and Ritov V.B. (2002). Dysfunction of mitochondria in human skeletal muscle in type 2 diabetes. Diabetes 51, 2944–2950. 10.2337/DIABETES.51.10.2944. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]15. Heilbronn L.K., Seng K.G., Turner N., Campbell L. V., and Chisholm D.J. (2007). Markers of Mitochondrial Biogenesis and Metabolism Are Lower in Overweight and Obese Insulin-Resistant Subjects. J. Clin. Endocrinol. Metab. 92, 1467–1473. 10.1210/JC.2006-2210. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]16. Heinonen S., Buzkova J., Muniandy M., Kaksonen R., Ollikainen M., Ismail K., Hakkarainen A., Lundbom J., Lundbom N., Vuolteenaho K., et al. (2015). Impaired Mitochondrial Biogenesis in Adipose Tissue in Acquired Obesity. Diabetes 64, 3135–3145. 10.2337/DB14-1937. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]17. Lindinger P.W., Christe M., Eberle A.N., Kern B., Peterli R., Peters T., Jayawardene K.J.I., Fearnley I.M., and Walker J.E. (2015). Important mitochondrial proteins in human omental adipose tissue show reduced expression in obesity. J. Proteomics 124, 79–87. 10.1016/J.JPROT.2015.03.037. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]18. Pa li K., Kahl S., Mastrototaro L., Strassburger K., Pesta D., Herder C., Pützer J., Dewidar B., Hendlinger M., Granata C., et al. (2022). Mitochondrial respiration is decreased in visceral but not subcutaneous adipose tissue in obese individuals with fatty liver disease. J. Hepatol. 77, 1504–1514. 10.1016/J.JHEP.2022.08.010. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]19. Wai T., and Langer T. (2016). Mitochondrial Dynamics and Metabolic Regulation. Trends Endocrinol. Metab. 27, 105–117. 10.1016/J.TEM.2015.12.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]20. Mishra P., and Chan D.C. (2016). Metabolic regulation of mitochondrial dynamics. J. Cell Biol. 212, 379–387. 10.1083/jcb.201511036. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]21. Inoue M., Chang L., Hwang J., Chiang S.H., and Saltiel A.R. (2003). The exocyst complex is required for targeting of Glut4 to the plasma membrane by insulin. Nat. 2003 4226932 422, 629–633. 10.1038/nature01533. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]22. Chen X.W., Leto D., Chiang S.H., Wang Q., and Saltiel A.R. (2007). Activation of RalA Is Required for Insulin-Stimulated Glut4 Trafficking to the Plasma Membrane via the Exocyst and the Motor Protein Myo1c. Dev. Cell 13, 391–404. 10.1016/J.DEVCEL.2007.07.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]23. Nozaki S., Ueda S., Takenaka N., Kataoka T., and Satoh T. (2012). Role of RalA downstream of Rac1 in insulin-dependent glucose uptake in muscle cells. Cell. Signal. 24, 2111–2117. 10.1016/J.CELLSIG.2012.07.013. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]24. Chen X.W., Leto D., Xiao J., Goss J., Wang Q., Shavit J.A., Xiong T., Yu G., Ginsburg D., Toomre D., et al. (2011). Exocyst function regulated by effector phosphorylation. Nat. Cell Biol. 2011 135 13, 580–588. 10.1038/ncb2226. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]25. Karunanithi S., Xiong T., Uhm M., Leto D., Sun J., Chen X.W., and Saltiel A.R. (2014). A Rab10:RalA G protein cascade regulates insulin-stimulated glucose uptake in adipocytes. Mol. Biol. Cell 25, 3059–3069. 10.1091/MBC.E14-06-1060/ASSET/IMAGES/LARGE/3059FIG7.JPEG. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]26. Skorobogatko Y., Dragan M., Cordon C., Reilly S.M., Hung C.W., Xia W., Zhao P., Wallace M., Lackey D.E., Chen X.W., et al. (2018). RalA controls glucose homeostasis by regulating glucose uptake in brown fat. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 115, 7819–7824. 10.1073/PNAS.1801050115/SUPPL_FILE/PNAS.1801050115.SAPP.PDF. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]27. Chen Q., Rong P., Zhu S., Yang X., Ouyang Q., Wang H.Y., and Chen S. (2019). Targeting RalGAPα1 in skeletal muscle to simultaneously improve postprandial glucose and lipid control. Sci. Adv. 5. 10.1126/SCIADV.AAV4116. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]28. Valentine J.M., Ahmadian M., Keinan O., Abu-Odeh M., Zhao P., Zhou X., Keller M.P., Gao H., Yu R.T., Liddle C., et al. (2022). β3-Adrenergic receptor downregulation leads to adipocyte catecholamine resistance in obesity. J. Clin. Invest. 132. 10.1172/JCI153357. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]29. Wikstrom J.D., Mahdaviani K., Liesa M., Sereda S.B., Si Y., Las G., Twig G., Petrovic N., Zingaretti C., Graham A., et al. (2014). Hormone-induced mitochondrial fission is utilized by brown adipocytes as an amplification pathway for energy expenditure. EMBO J. 33, 418. 10.1002/EMBJ.201385014. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]30. Reilly S.M., Hung C.W., Ahmadian M., Zhao P., Keinan O., Gomez A. V., DeLuca J.H., Dadpey B., Lu D., Zaid J., et al. (2020). Catecholamines suppress fatty acid re-esterification and increase oxidation in white adipocytes via STAT3. Nat. Metab. 2020 27 2, 620–634. 10.1038/s42255-020-0217-6. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]31. Herzig S., and Shaw R.J. (2017). AMPK: guardian of metabolism and mitochondrial homeostasis. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2017 192 19, 121–135. 10.1038/nrm.2017.95. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]32. Zhao P., Wong K. in, Sun X., Reilly S.M., Uhm M., Liao Z., Skorobogatko Y., and Saltiel A.R. (2018). TBK1 at the Crossroads of In ammation and Energy Homeostasis in Adipose Tissue. Cell 172, 731–743.e12. 10.1016/J.CELL.2018.01.007. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]33. Liesa M., and Shirihai O.S. (2013). Mitochondrial Dynamics in the Regulation of Nutrient Utilization and Energy Expenditure. Cell Metab. 17, 491–506. 10.1016/J.CMET.2013.03.002. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]34. Wilson-Fritch L., Nicoloro S., Chouinard M., Lazar M.A., Chui P.C., Leszyk J., Straubhaar J., Czech M.P., and Corvera S. (2004). Mitochondrial remodeling in adipose tissue associated with obesity and treatment with rosiglitazone. J. Clin. Invest. 114, 1281–1289. 10.1172/JCI21752. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]35. Choo H.J., Kim J.H., Kwon O.B., Lee C.S., Mun J.Y., Han S.S., Yoon Y.S., Yoon G., Choi K.M., and Ko Y.G. (2006). Mitochondria are impaired in the adipocytes of type 2 diabetic mice. Diabetologia 49, 784–791. 10.1007/S00125-006-0170-2/FIGURES/7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]36. Chan D.C. (2020). Mitochondrial Dynamics and Its Involvement in Disease. 10.1146/annurev-pathmechdis-012419-032711 15, 235–259. 10.1146/ANNUREV-PATHMECHDIS-012419-032711. [PubMed] [CrossRef] [CrossRef] [Google Scholar]37. Song Z., Chen H., Fiket M., Alexander C., and Chan D.C. (2007). OPA1 processing controls mitochondrial fusion and is regulated by mRNA splicing, membrane potential, and Yme1L. J. Cell Biol. 178, 749–755. 10.1083/JCB.200704110. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]38. Mishra P., Carelli V., Manfredi G., and Chan D.C. (2014). Proteolytic Cleavage of Opa1 Stimulates Mitochondrial Inner Membrane Fusion and Couples Fusion to Oxidative Phosphorylation. Cell Metab. 19, 630–641. 10.1016/j.cmet.2014.03.011. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]39. Ge Y., Shi X., Boopathy S., McDonald J., Smith A.W., and Chao L.H. (2020). Two forms of opa1 cooperate to complete fusion of the mitochondrial inner-membrane. Elife 9. 10.7554/ELIFE.50973. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]40. Chang C.R., and Blackstone C. (2007). Cyclic AMP-dependent protein kinase phosphorylation of Drp1 regulates its GTPase activity and mitochondrial morphology. J. Biol. Chem. 282, 21583–21587. 10.1074/jbc.C700083200. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]41. Cribbs J.T., and Strack S. (2007). Reversible phosphorylation of Drp1 by cyclic AMP-dependent protein kinase and calcineurin regulates mitochondrial fission and cell death. EMBO Rep. 8, 939–944. 10.1038/SJ.EMBOR.7401062. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]42. Yan C., Liu D., Li L., Wempe M.F., Guin S., Khanna M., Meier J., Hoffman B., Owens C., Wysoczynski C.L., et al. (2014). Discovery and characterization of small molecules that target the GTPase Ral. 10.1038/nature13713. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]43. Kashatus D.F., Lim K.H., Brady D.C., Pershing N.L.K., Cox A.D., and Counter C.M. (2011). RALA and RALBP1 regulate mitochondrial fission at mitosis. Nat. Cell Biol. 2011 139 13, 1108–1115. 10.1038/ncb2310. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]44. Xiao Y.X., Lanza I.R., Swain J.M., Sarr M.G., Nair K.S., and Jensen M.D. (2014). Adipocyte Mitochondrial Function Is Reduced in Human Obesity Independent of Fat Cell Size. J. Clin. Endocrinol. Metab. 99, E209. 10.1210/JC.2013-3042. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]45. Spiegelman B.M., and Flier J.S. (2001). Obesity and the Regulation of Energy Balance. Cell 104, 531–543. 10.1016/S0092-8674(01)00240-9. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]46. Chen Q., Quan C., Xie B., Chen L., Zhou S., Toth R., Campbell D.G., Lu S., Shirakawa R., Horiuchi H., et al. (2014). GARNL1, a major RalGAP α subunit in skeletal muscle, regulates insulin-stimulated RalA activation and GLUT4 trafficking via interaction with 14–3-3 proteins. Cell. Signal. 26, 1636–1648. 10.1016/J.CELLSIG.2014.04.012. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]47. Marette A., Mauriège P., Marcotte B., Atgié C., Bouchard C., Thé Riault G., Bukowiecki L.J., Marceau P., Biron S., Nadeau A., et al. (1997). Regional variation in adipose tissue insulin action and GLUT4 glucose transporter expression in severely obese premenopausal women. Diabetologia 40, 590–598. [PubMed] [Google Scholar]48. Carvalho E., Jansson P., Nagaev I., Wenthzel A., and Smith U. (2001). Insulin resistance with low cellular IRS-1 expression is also associated with low GLUT4 expression and impaired insulin-stimulated glucose transport 1. FASEB J. 15, 1101–1103. 10.1096/FSB2FJ000435FJE. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]49. Lumeng C.N., Deyoung S.M., and Saltiel A.R. (2007). Macrophages block insulin action in adipocytes by altering expression of signaling and glucose transport proteins. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292. 10.1152/AJPENDO.00284.2006. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]50. Trayhurn P., Wang B., and Wood I.S. (2008). Hypoxia in adipose tissue: a basis for the dysregulation of tissue function in obesity? Br. J. Nutr. 100, 227–235. 10.1017/S0007114508971282. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]51. Rosen E.D., and Spiegelman B.M. (2006). Adipocytes as regulators of energy balance and glucose homeostasis. Nat. 2006 4447121 444, 847–853. 10.1038/nature05483. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]52. Perry R.J., Camporez J.P.G., Kursawe R., Titchenell P.M., Zhang D., Perry C.J., Jurczak M.J., Abudukadier A., Han M.S., Zhang X.M., et al. (2015). Hepatic Acetyl CoA Links Adipose Tissue Inflammation to Hepatic Insulin Resistance and Type 2 Diabetes. Cell 160, 745–758. 10.1016/J.CELL.2015.01.012. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]53. Giralt M., and Villarroya F. (2013). White, Brown, Beige/Brite: Different Adipose Cells for Different Functions? Endocrinology 154, 2992–3000. 10.1210/EN.2013-1403. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]54. Bartelt A., and Heeren J. (2013). Adipose tissue browning and metabolic health. Nat. Rev. Endocrinol. 2013 101 10, 24–36. 10.1038/nrendo.2013.204. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]55. Forner F., Kumar C., Luber C.A., Fromme T., Klingenspor M., and Mann M. (2009). Proteome differences between brown and white fat mitochondria reveal specialized metabolic functions. Cell Metab. 10, 324–335. 10.1016/J.CMET.2009.08.014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]56. Banerjee R., Mukherjee A., and Nagotu S. (2021). Mitochondrial dynamics and its impact on human health and diseases: inside the DRP1 blackbox. J. Mol. Med. 2021 1001 100, 1–21. 10.1007/S00109-021-02150-7. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]57. Jheng H.-F., Tsai P.-J., Guo S.-M., Kuo L.-H., Chang C.-S., Su I.-J., Chang C.-R., and Tsai Y.-S. (2012). Mitochondrial Fission Contributes to Mitochondrial Dysfunction and Insulin Resistance in Skeletal Muscle. Mol. Cell. Biol. 32, 309–319. 10.1128/MCB.05603-11/SUPPL_FILE/MCB-MCB05603-11-S02.MOV. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]58. Kugler B.A., Gundersen A.E., Li J., Deng W., Eugene N., Gona P.N., Houmard J.A., and Zou K. (2019). Roux-en-Y gastric bypass surgery restores insulin-mediated glucose partitioning and mitochondrial dynamics in primary myotubes from severely obese humans. Int. J. Obes. 2019 443 44, 684–696. 10.1038/s41366-019-0469-y. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]59. Gundersen A.E., Kugler B.A., McDonald P.M., Veraksa A., Houmard J.A., and Zou K. (2020). Altered mitochondrial network morphology and regulatory proteins in mitochondrial quality control in myotubes from severely obese humans with or without type 2 diabetes. Appl. Physiol. Nutr. Metab. 45, 283–293. 10.1139/APNM-2019-0208/ASSET/IMAGES/LARGE/APNM-2019-0208F6.JPEG. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]60. Li X., Yang L., Mao Z., Pan X., Zhao Y., Gu X., Eckel-Mahan K., Zuo Z., Tong Q., Hartig S.M., et al. (2020). Novel role of dynamin-related-protein 1 in dynamics of ER-lipid droplets in adipose tissue. FASEB J. 34, 8265. 10.1096/FJ.201903100RR. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]61. Kugler B.A., Deng W., Duguay A.L., Garcia J.P., Anderson M.C., Nguyen P.D., Houmard J.A., and Zou K. (2021). Pharmacological inhibition of dynamin-related protein 1 attenuates skeletal muscle insulin resistance in obesity. Physiol. Rep. 9, e14808. 10.14814/PHY2.14808. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]62. Finocchietto P., Perez H., Blanco G., Miksztowicz V., Marotte C., Morales C., Peralta J., Berg G., Poderoso C., Poderoso J.J., et al. (2022). Inhibition of mitochondrial fission by Drp-1 blockade by short-term leptin and Mdivi-1 treatment improves white adipose tissue abnormalities in obesity and diabetes. Pharmacol. Res. 178, 106028. 10.1016/J.PHRS.2021.106028. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]63. Wang L., Ishihara T., Ibayashi Y., Tatsushima K., Setoyama D., Hanada Y., Takeichi Y., Sakamoto S., Yokota S., Mihara K., et al. (2015). Disruption of mitochondrial fission in the liver protects mice from diet-induced obesity and metabolic deterioration. Diabetologia 58, 2371–2380. 10.1007/S00125-015-3704-7/FIGURES/6. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]64. Mooli R.G.R., Mukhi D., Chen Z., Buckner N., and Ramakrishnan S.K. (2020). An indispensable role for dynamin-related protein 1 in beige and brown adipogenesis. J. Cell Sci. 133. 10.1242/JCS.247593/266522/AM/AN-INDISPENSABLE-ROLE-FOR-DYNAMIN-RELATED-PROTEIN. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]65. Adachi Y., Kato T., Yamada T., Murata D., Arai K., Stahelin R. V., Chan D.C., Iijima M., and Sesaki H. (2020). Drp1 Tubulates the ER in a GTPase-Independent Manner. Mol. Cell 80, 621–632.e6. 10.1016/J.MOLCEL.2020.10.013. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]66. Czech M.P. (2017). Insulin action and resistance in obesity and type 2 diabetes. Nat. Med. 2017 237 23, 804–814. 10.1038/nm.4350. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]67. Aune U.L., Ruiz L., and Kajimura S. (2013). Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. J. Vis. Exp. 10.3791/50191. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]68. Xia W., Pessentheiner A.R., Hofer D.C., Amor M., Schreiber R., Schoiswohl G., Eichmann T.O., Walenta E., Itariu B., Prager G., et al. (2018). Loss of ABHD15 Impairs the Anti-lipolytic Action of Insulin by Altering PDE3B Stability and Contributes to Insulin Resistance. Cell Rep. 23, 1948–1961. 10.1016/J.CELREP.2018.04.055. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]69. Huang J., Linares J.F., Duran A., Xia W., Saltiel A.R., Müller T.D., Diaz-Meco M.T., and Moscat J. (2021). NBR1 is a critical step in the repression of thermogenesis of p62-deficient adipocytes through PPARγ. Nat. Commun. 12. 10.1038/S41467-021-23085-0. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]70. Wabitsch M., Brenner R.E., Melzner I., Braun M., Möller P., Heinze E., Debatin K.M., and Hauner H. (2001). Characterization of a human preadipocyte cell strain with high capacity for adipose differentiation. Int. J. Obes. 2001 251 25, 8–15. 10.1038/sj.ijo.0801520. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]71. Schweiger M., Romauch M., Schreiber R., Grabner G.F., Hütter S., Kotzbeck P., Benedikt P., Eichmann T.O., Yamada S., Knittelfelder O., et al. (2017). Pharmacological inhibition of adipose triglyceride lipase corrects high-fat diet-induced insulin resistance and hepatosteatosis in mice. Nat. Commun. 2017 81 8, 1–15. 10.1038/ncomms14859. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]72. Arner E., Mejhert N., Kulyté A., Balwierz P.J., Pachkov M., Cormont M., Lorente-Cebrián S., Ehrlund A., Laurencikiene J., Hedén P., et al. (2012). Adipose Tissue MicroRNAs as Regulators of CCL2 Production in Human Obesity. Diabetes 61, 1986–1993. 10.2337/DB11-1508. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]73. Civelek M., Wu Y., Pan C., Raulerson C.K., Ko A., He A., Tilford C., Saleem N.K., Stančáková A., Scott L.J., et al. (2017). Genetic Regulation of Adipose Gene Expression and Cardio-Metabolic Traits. Am. J. Hum. Genet. 100, 428–443. 10.1016/J.AJHG.2017.01.027. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]74. Matthews D.R., Hosker J.P., Rudenski A.S., Naylor B.A., Treacher D.F., and Turner R.C. (1985). Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man. Diabetologia 28, 412–419. 10.1007/BF00280883. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]75. Mina A.I., LeClair R.A., LeClair K.B., Cohen D.E., Lantier L., and Banks A.S. (2018). CalR: A Web-Based Analysis Tool for Indirect Calorimetry Experiments. Cell Metab. 28, 656–666.e1. 10.1016/J.CMET.2018.06.019. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]76. Huynh F.K., Green M.F., Koves T.R., and Hirschey M.D. (2014). Measurement of fatty acid oxidation rates in animal tissues and cell lines. Methods Enzymol. 542, 391–405. 10.1016/B978-0-12-416618-9.00020-0. [PMC free article] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]