醣時
本翻譯僅作學術交流用，無商業意圖，請勿轉載，如有疑議問請來信
這項研究分析了血清樣本的凍融次數、提取狀態、儲存溫度對血脂分析的影響。結果顯示，1至3次的凍融對大多數高豐度代謝物影響輕微，而冷凍前的脂蛋白分離則對HDL和LDL膽固醇以及VLDL游離脂肪酸的濃度有顯著變化。建議新鮮血清樣本用於密度分離，以減少分析誤差。
Effects of sample handling and storage on quantitative lipid analysis in human serum
樣本處理和儲存對人類血清定量脂質分析的影響
Zivkovic AM, Wiest MM, Nguyen UT, Davis R, Watkins SM, German JB. Effects of sample handling and storage on quantitative lipid analysis in human serum. Metabolomics. 2009;5(4):507-516. doi:10.1007/s11306-009-0174-2
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20046864/
Abstract
There is sparse information about specific storage and handling protocols that minimize analytical error and variability in samples evaluated by targeted metabolomics. Variance components that affect quantitative lipid analysis in a set of human serum samples were determined. The effects of freeze-thaw, extraction state, storage temperature, and freeze-thaw prior to density-based lipoprotein fractionation were quantified. The quantification of high abundance metabolites, representing the biologically relevant lipid species in humans, was highly repeatable (with coefficients of variation as low as 0.01 and 0.02) and largely unaffected by 1–3 freeze-thaw cycles (with 0–8% of metabolites affected in each lipid class). Extraction state had effects on total lipid class amounts, including decreased diacylglycerol and increased phosphatidylethanolamine in thawed compared with frozen samples. The effects of storage temperature over 1 week were minimal, with 0–4% of metabolites affected by storage at 4°C, −20°C, or −80°C in most lipid classes, and 19% of metabolites in diacylglycerol affected by storage at −20°C. Freezing prior to lipoprotein fractionation by density ultracentrifugation decreased HDL free cholesterol by 37% and VLDL free fatty acid by 36%, and increased LDL cholesterol ester by 35% compared with fresh samples. These findings suggest that density-based fractionation should preferably be undertaken in fresh serum samples because up to 37% variability in HDL and LDL cholesterol could result from a single freeze-thaw cycle. Conversely, quantitative lipid analysis within unfractionated serum is minimally affected even with repeated freeze-thaw cycles.
摘要
目前針對通過目標代謝組學評估的樣本中，具體儲存和處理協議以最大限度減少分析誤差和變異的信息較少。本研究確定了影響一組人類血清樣本中定量脂質分析的變異成分。量化了冷凍-解凍、萃取狀態、儲存溫度及冷凍-解凍後進行密度分離脂蛋白分級的影響。代表人體生物相關脂質類的高豐度代謝物的量化高度可重複（變異係數低至 0.01 和 0.02），且在 1-3 次冷凍-解凍循環中基本不受影響（每個脂質類中受影響的代謝物為 0-8%）。萃取狀態對總脂質類量有影響，包括解凍樣本中二酰基甘油減少和磷脂酰乙醇胺增加。儲存溫度在 1 週內的影響很小，在大多數脂質類中，儲存在 4°C、-20°C 或 -80°C 對 0-4% 的代謝物有影響，而儲存在 -20°C 對 19% 的二酰基甘油代謝物有影響。冷凍後進行密度超速離心法分離脂蛋白使 HDL 游離膽固醇減少 37%，VLDL 游離脂肪酸減少 36%，而 LDL 膽固醇酯增加 35%，相較於新鮮樣本。因此，建議密度分離應優先在新鮮血清樣本中進行，因為單次冷凍-解凍循環可能導致 HDL 和 LDL 膽固醇高達 37% 的變異。相比之下，未分級血清中的定量脂質分析即使在多次冷凍-解凍循環中也幾乎不受影響。
1 引言
在進行目標代謝組學和脂蛋白分離的組成分析之前，血清樣本的儲存和處理不當可能顯著影響其準確性，與分析新鮮樣本相比存在差異。然而，有關特定儲存條件和處理協議以最大限度減少誤差和變異的信息很少。現有文獻僅探討了樣本儲存和處理對總膽固醇（TC）和三酸甘油酯（TG）酶分析的影響。這些實驗的結果不一。一些研究發現，冷凍和儲存時間會增加脂質濃度（Evans et al. 1997; Pini et al. 1990; Tiedink and Katan 1989; Wood et al. 1980）；其他研究則發現脂質濃度下降（Bausserman et al. 1994; Donnelly et al. 1995; Ekbom et al. 1996; Evans et al. 1995, 1997; Nanjee and Miller 1990; Simo et al. 2001; Tiedink and Katan 1989）；還有一些研究發現，根據初始濃度的不同，脂質濃度會增加或減少（Bachorik et al. 1980, 1982）。其他研究者則發現脂質濃度沒有顯著變化（Bausserman et al. 1994; Donnelly et al. 1995; Kuchmak et al. 1982; Nanjee and Miller 1990; Stokes et al. 1986; Wood et al. 1980）。只有兩項研究檢查了多次冷凍-解凍循環的影響。儲存於 -80°C 並經歷 1-3 次冷凍-解凍循環的樣本在 24 個月後顯示出組成變化，使用酶檢測試劑盒分析（Kronenberg et al. 1994），但在 1 和 3 次冷凍-解凍循環之間沒有差異。另一項研究也發現沒有差異，但冷凍-解凍的樣本僅相互比較，而不是與新鮮樣本比較（Comstock et al. 2001）。
據我們所知，尚無關於血清樣本的儲存和處理及其對分離脂質類中脂肪酸（FA）組成影響的信息，這些組成通過定量脂質分析測量，包括整個血清或密度分離的血清。因此，本研究的目的是詳細檢查影響脂質組成分析質量的儲存和處理條件，使用包括制備型高效液相色譜（HPLC）和薄層色譜（TLC）以及氣相色譜（GC）-火焰離子化檢測（FID）在內的多種平台組合。特別是，我們旨在確定多次冷凍-解凍循環、萃取時樣本狀態（冷凍或解凍）、儲存溫度以及血清冷凍後進行脂蛋白分離對人類樣本中定量脂質分析的影響。
2 材料與方法
為研究樣本儲存和處理的整體影響，進行了兩個實驗。實驗1的樣本購自PromedDx（馬薩諸塞州諾頓），實驗2的新鮮血清樣本來自一位健康志願者的隔夜禁食後收集。每個實驗的具體方法、實驗設計和統計分析如下所述。
2.1 定量脂質分析
在實驗1和實驗2中，定量脂質分析均由Lipomics Technologies, Inc.（加州西薩克拉門托）根據Watkins等人（2002）的方法進行。簡而言之，根據Folch等人（1957）的方法，使用氯仿-甲醇（2:1，v/v）+ 0.05% 丁基羥基甲苯，在真實內部標準的存在下進行脂質萃取。每次分析使用200 μl血清。每個萃取物中的單個脂質類別——TG（二酰基甘油（DG））、游離脂肪酸（FFA）、磷脂酰膽鹼（PC）、溶血磷脂酰膽鹼（LY）、磷脂酰乙醇胺（PE）、膽固醇酯（CE）和游離膽固醇（FC）——通過制備型高效液相色譜（Cao等人，2008）分離磷脂類，通過薄層色譜分離中性脂類。每個分離的脂質類別（除FC外，因該類脂質不含FA）在氮氣下密封的小瓶中於100°C下用3 N 甲醇鹽酸轉酯化60分鐘。將所得的脂肪酸甲酯用含0.05%丁基羥基甲苯的己烷從混合物中萃取，並在氮氣下密封己烷萃取物以準備進行氣相色譜分析。脂肪酸甲酯使用裝有30-m DB-225MS毛細管柱（Agilent Technologies, Folsom, CA）和火焰離子化檢測器的氣相色譜儀（Agilent Technologies 型號6890，Wilmington, DE）分離和定量。在每個脂質類別中共測量了37種脂肪酸，包含以下成分：14:0、15:0、16:0、18:0、20:0、22:0、24:0、14:1n5、16:1n7、反式（t）16:1n7、18:1n9、t18:1n9、18:1n7、18:2n6、t18:2n6、18:3n6、18:3n3、18:4n3、20:1n9、20:2n6、20:3n9、20:3n6、20:4n6、20:3n3、20:4n3、20:5n3、22:1n9、22:2n6、22:4n6、22:5n3、22:6n3、24:1n9 和 24:6n3，以及 16:0、18:0、18:1n9 和 18:1n7 的醚類衍生物。
2.2 數據處理和統計分析
使用確定的單個脂肪酸（FA）量計算單個脂質類別的質量，並表示為 nmol FA/g 血清。單個 FA 數據分析為 mol.%，即計算每個單個 FA 相對於該脂質類別內所有 FA 濃度總和的百分比。脂質類別組成分析包括單個 FA 濃度和 FA 類別：飽和脂肪酸（SFA）、單不飽和脂肪酸（MUFA）、多不飽和脂肪酸（PUFA）以及 omega-3（n3）、-6（n6）、-7（n7）和 -9（n9）。在應用正式統計方法之前，數據進行了預處理，以應對代謝組學分析中的大量數據。缺失觀測值超過 30% 的代謝物被排除，在計算脂質類別總量後，超過平均值 4 倍標準差的觀測值也被排除在統計分析之外。
變化檢測圖用於確定觀察到的信號是否大於預期的隨機變化（噪聲）。變化檢測圖按以下方式生成：使用學生t檢驗計算每個代謝物的比較p值，並從小到大排序。將每個感興趣比較的對數 p 值與排名的對數繪圖。使用蒙特卡洛置換法確定每個排名下隨機預期的p值分佈，使用每組縮放至平均值並合併的值進行計算。多次置換的第 N 排名的p值用於構建第 N 位的箱形圖。排名與對數 p 值線截水平行線的 y 軸值指示超過隨機預期最小 p 值的觀察到的 p 值數量。
數據通過直方圖檢查正態性。如果檢測到非正態性，則進行對數轉換並重新分析數據。對數轉換數據的結果（p值）與未轉換數據的結果相似，因此使用未轉換數據進行分析和報告。
所有統計分析均使用 R 軟件程序（The R Foundation for Statistical Computing）進行。
2.3 實驗1：研究設計、方法和統計
假設多次冷凍-解凍循環、預先提取狀態（冷凍或解凍）以及儲存溫度會導致血清樣本中脂肪酸濃度的變化。本實驗的具體目標是確定這三個關鍵因素的影響。 （1）通過比較新鮮樣本與已經冷凍一次、兩次或三次的樣本來確定冷凍-解凍循環次數的影響。 （2）通過比較已冷凍提取的樣品與已解凍提取的樣品來確定提取狀態的影響。 （3）通過比較在4°C、-20°C和-80°C儲存了1周的樣品來確定儲存溫度的影響。為了解決這些具體目標，進行了以下實驗方案。
來自3名健康志願者的新鮮、非禁食的血清樣品是從PromedDx（Norton, MA）購買的。根據常規靜脈穿刺程序由食品和藥物管理局監管的設施收集血液，並按照常規程序將血清從血液中分離出來。樣本在冰箱中保存（即從未冷凍），血液採集後的第二天放在冷卻包中運送，並在收集後48小時內進行分析，因此，這些樣本被認為是“新鮮的”。
每個來自不同個體的血清進行了所有條件的測試。在每種處理類型的每個批次內進行了三次重複測試，總共為每種分析產生了九個樣本。每組樣品在以下條件下進行了測試：（a）新鮮，從未冷凍過；（b）1次冷凍-解凍循環；（c）2次冷凍-解凍循環；（d）3次冷凍-解凍循環；（e）冷凍一次，直接從冷凍樣品提取脂質；（f）1次冷凍-解凍循環，再次冷凍，直接從冷凍樣品提取脂質；（g）在4°C儲存1周；（h）1次冷凍-解凍循環，-20°C儲存1周；（i）1次冷凍-解凍循環，-80°C儲存1周。處理（a）樣品在抵達實驗室後立即提取。所有其他樣品的等份盡可能迅速冷凍。來自處理（e）和（f）的樣品在同一時間提取和分析。處理（g）、（h）和（i）的樣品在同一時間提取和分析。
對於每個在實驗1中新鮮血清樣品的5個樣品重複，計算了每個脂質代謝物（例如所有脂質類中的所有脂肪酸）的變異系數（CV），即標準差除以平均值。結果以圖表形式呈現，顯示新鮮樣品測量的變異程度。使用單因素方差分析（ANOVA）檢驗了冷凍-解凍循環次數（1×、2×、3×）的影響，比較了冷凍一次（處理b）、兩次（處理c）和三次（處理d）的樣品與新鮮樣品（處理a）。採用t檢驗進行事後分析，以確定每個處理（b、c和d）與新鮮樣品（處理a）之間的顯著差異。通過t檢驗評估了提取冷凍樣品與解凍樣品（處理b + c vs. e + f）之間的溫度效應。使用單因素方差分析比較了在4°C、-20°C和-80°C儲存1周的溫度效應。採用t檢驗進行事後分析，以確定在每個溫度下儲存1周與新鮮樣品之間的顯著差異。
2.4 實驗2：研究設計、方法和統計
我們假設冷凍會影響密度梯度超速離心法分離的脂質蛋白內的脂質組成。從一名健康成年人在一夜禁食後收集了一份血液樣本。加州大學戴維斯分校的人體研究倫理委員會批准了研究方案，並從受試者獲得了書面知情同意。血液在室溫下的血液收集管中凝固30分鐘，然後在1,600 rpm和4°C下離心10分鐘。血清在血液收集後60分鐘內被分成6份2ml的等份。其中三份樣品在冰上保持新鮮（即從未冷凍）。另外三份樣品立即放入-80°C冰箱中，冷凍2小時，然後在冰上解凍30分鐘。
這些樣品同時通過改良了Brousseau等人報告的快速分離微法的順序超速離心法進行分離（Brousseau等人，1993）。離心過程在血液收集後6小時內開始，並在同一天完成，使用Sorvall RC-120GX微型超速離心機（Sorvall S120-AT2轉子，120,000 rpm）。為了分離VLDL，將600μl的d = 1.006 kg/l氯化鈉溶液轉移到每個管中，並加入1.2ml的新鮮或解凍樣品，並進行超速離心（1小時23分鐘，8°C）。通過抽取頂部400μl的樣品作為VLDL。為了準備LDL，餘下的樣品上層加入了d = 1.34 kg/l氯化鈉/溴化鈉溶液，進行超速離心（2小時5分鐘，8°C），並抽取頂部400μl。HDL的製備方式類似，通過加入d = 1.21 kg/l氯化鈉/溴化鈉溶液，然後進行超速離心（3小時30分鐘，8°C），並抽取頂部400μl。所有結果的分數立即冷凍保存在-80°C，直到進行脂質成分分析為止。
由於只有兩個因子水平（新鮮和冷凍），所以使用雙側未配對t檢驗，假設兩組之間的變異數相等。對於每個脂質蛋白分離物中的每種代謝物，分別計算了雙側t檢驗和Bartlett方差檢驗的P值。當t檢驗的P值<0.05，且Bartlett檢驗的P值>0.05時，超速離心後新鮮和冷凍樣品的平均代謝物濃度存在顯著差異。
結果
圖1顯示了新鮮血清樣本的5個重複測量中所有代謝物（例如每個脂質類中的每個脂肪酸）的變異程度，以每個代謝物的CV表示。對於所有高豐度代謝物，CV都很低，許多關鍵代謝物的值都低至0.01和0.02，這些代謝物在人類生物學中具有重要意義（例如TG18:1n9、TG總脂類、CE16:0、TG16:0、FFA18:1n9、CE20:5n3、CE20:4n6）。測量的代謝物中有70%的CV<0.33，50%的CV<0.15，CE、DG、FFA、LY、PC、PE和TG的總脂類的CV分別為0.07、0.29、0.08、0.03、0.13、0.06和0.02。
圖1
在新鮮血清中測量的代謝物的變異係數（CV）：對於來自實驗1的同一新鮮血清樣本的5個重複測量，計算了每個測量的代謝物（例如每個脂質類中的每個脂肪酸）的CV。這些CV以所有代謝物的降序排列繪製。低豐度的代謝物（例如DG20:4n3、PE14:1n5）具有較高的CV，而高豐度的代謝物（例如TG18:1n9、CE16:0）的CV非常低，低至0.01和0.02。這說明了在人類生物學中具有重要意義的代謝物的分析方法具有很高的重複性。
實驗1的結果摘要如表1所示，顯示了從新鮮血清中回收的每個脂質類的總量，以及在每個處理中被發現受到顯著影響的每個脂質類中的代謝物百分比。實驗2的類似結果摘要如表5所示，顯示了在未分離的血清中回收的脂質的總量以及每個脂質類在各個脂蛋白分子內的總量，以及在每個脂蛋白分子中被冷凍發現受到顯著影響的每個脂質類中的代謝物百分比。根據第2.2節中所述標準，每個脂質類中排除的代謝物數量分別為CE，DG，FFA，LY，PC，PE和TG，分別為7、11、5、6、1、2和4個。這些代謝物往往是非常低豐度的代謝物，包括22:2n6、18:4n3、20:3n3、24:6n3、dm16:0、dm18:0、dm18:1n7、dm18:1n9、t16:1n7、t18:1n9和t18:2n6。
表格1：實驗1中每種處理方法中，每種脂質類別的總脂質量和在該脂質類別中顯著不同的代謝物的百分比
在本研究中，多次冷凍解凍循環對血清脂質組成的影響非常有限。在實驗1中，經歷1、2或3次冷凍解凍循環的樣本中，每種脂質類別內<1%的代謝物與新鮮樣本相比有顯著差異。進行事後分析以確定每種處理之間的具體變化，並對所有比較進行了檢驗。表2中僅列出了與新鮮樣本顯著不同的代謝物（共262種）。在1次冷凍解凍循環後，DG20:3n9、FFA22:5n3、PE18:0和PE20:4n3明顯減少。DG20:3n9、FFA22:5n3和PE20:4n3的減少幅度約為50-90%，而PE18:0僅從新鮮樣本減少約9%。CE20:2n6在經歷兩次和三次冷凍解凍循環後減少了50-60%。DG20:3n9、DG20:2n6、LY20:5n3在經歷兩次冷凍解凍循環後也減少了30-35%，而LY16:0和TG22:0在經歷兩次冷凍解凍循環後分別增加了8%和38%。
表格2：血清中的代謝物，在新鮮樣本與經歷一次、兩次或三次冷凍後分析時顯著不同。
與解凍樣本相比，冷凍樣本的提取對整體脂質類別，特別是DG和PE，產生了相反的影響。如表3所示，262種代謝物中有9種受到提取狀態的顯著影響，其中包括兩種二甲基(dm)脂肪酸PCdm18:0和PCdm18:1n9的增加約40%，以及與冷凍樣本相比提取解凍樣本時PE增加了27%。另一方面，與冷凍樣本相比提取解凍樣本時，DG18:3n6、LY20:4n6、LY22:5n3、PE16:0和LYPUFA減少了10-50%，而DG減少了26%。
表格3：血清中的代謝物，在提取時解凍樣本與冷凍樣本之間存在顯著差異。
在1週的存儲溫度下，對於8個脂質類別（CE、FFA、LY、PC、PE和TG）中的7個類別（4°C、-20°C和-80°C），影響較小，有0-4%的代謝物受到顯著影響，而在DG脂質類別中，有19%的代謝物受到-20°C存儲的影響（見表1）。存儲在4°C的樣品中，與新鮮樣本相比，5種DG代謝物的濃度降低了20-50%，CE20:2n6減少了50%（見表4）。存儲在-20°C的樣品中，CE20:2n6和DG20:3n9減少了50%，但TG22:0增加了45%，而存儲在-80°C的樣品中，DGdm減少了50%，PCn7物種減少了3%，而TG22:0則與新鮮樣本相比再次增加了45%。
表格4：與新鮮樣本相比，在4°C、-20°C和-80°C存儲1週後受到顯著影響的血清中的代謝物。
在實驗2中，使用配對的學生t檢驗來比較新鮮血清與被分離成VLDL、LDL和HDL的冷凍血清中測量的代謝物（見表5）。在HDL中，262種代謝物中有10種受到冷凍分離前的影響，包括PC18:2n6的21%損失和游離膽固醇(FC)總脂類的37%損失，以及與新鮮樣本相比幾種LY和飽和PC物種的增加（見表6）。在來自冷凍樣本的LDL中，相對於新鮮樣本的LDL，262種代謝物中有13種發生了顯著變化，其中包括CE的35%增加，以及幾種長鏈TG PUFA的增加（見表7）。在VLDL中，262種代謝物中有15種受到顯著影響，包括幾種LY物種的增加，幾種TG物種的減少，以及FFA總脂類的顯著36%減少（見表8）。
Table 5：血清和分離脂蛋白（HDL、LDL、VLDL）中的脂質類總量，以及在每個脂質類中受冷凍影響的代謝物的百分比，實驗2
討論
處理和處理過程中的變異成分是可加的，因此可能會對結果產生顯著的偏差。過去的研究探討了貯存和處理條件對用酶法和免疫檢測測定的脂質組成的影響，而在本研究中，採用了組合預備HPLC和TLC後的定量GC-FID進行了組成分析。在冷凍解凍循環和低溫貯存期間發生的脂蛋白粒子和脂質微環境的結構變化可能會影響酶法檢測脂質組成的質量。然而，正如本研究所示，通過GC-FID測定的脂質組成本身可能受到的影響較小。在8個脂質類別中，不到1%的代謝物受到一次、兩次或三次冷凍解凍循環的顯著影響。
在4°C、-20°C和-80°C貯存1周只對血清脂質組成產生較小的影響，在大多數脂質類中，0-4%的代謝物受到影響。本研究未考察更長的貯存時間，這可能會導致更多的差異。一項早期的研究發現，從11到27周的貯存時間影響逐漸增加（Tiedink and Katan 1989）。需要進一步的研究來探討貯存時間超過1周的溫度效應。即使在1周的貯存期間，貯存在較低溫度（-20°C和-80°C相比於4°C）是有益的，特別是減少對DG物種組成的變化，其中19%受到-20°C貯存的影響。
在密度超速離心法分離脂蛋白之前冷凍樣本會明顯改變HDL和LDL膽固醇濃度，以及VLDL游離脂肪酸濃度。冷凍和解凍引起的脂蛋白結構變化可能會影響顆粒的密度特性和/或引起顆粒的聚集（Castile and Taylor 1999; Cevc and Richardsen 1999）。凍融引起的代謝物差異的其他可能原因包括酶催化的水解和合成、脂蛋白之間的脂質酶催化轉移，以及非酶催化的氧化。磷脂、甘油三酯和二甘油酯被血清中殘留的脂肪酶水解，膽固醇酯被酯酶水解，這些酶可能在每次解凍後重新活化，可能參與其中。冷凍後，水解產物增加，底物減少，這可能是脂肪酶活性的表徵。例如，在HDL中，LY18:2n6增加，而PC18:2n6在冷凍解凍後減少。與新鮮血清相比，冷凍血清中HDL游離膽固醇減少了37%，VLDL游離脂肪酸減少了36%，而LDL膽固醇則增加了35%。某些更易揮發的物種（例如，較長鏈、不飽和的脂肪酸）的非酶催化氧化也可能參與其中。例如，在VLDL甘油三酯中，包括TG22:4n6和TG20:4n3在內的幾種長鏈PUFA物種減少。然而，這些也是非常低豐度的代謝物，因此新鮮樣本與冷凍樣本之間的變異性可能是由於它們作為低豐度代謝物的測量固有的變異性，而不是由於氧化所引起的。
本研究的發現表明，通過仔細和一致的處理，未分離的血清樣本可以儲存以進行後續的定量脂質分析，對於大多數人體中具有生物學意義的脂質物種的定量脂質組成只有輕微的影響。我們建議及時將最小合理體積的樣本存儲在最低可能的溫度（例如-80°C）是有益的，以減少冷凍引入的定量脂質代謝物變異性。如果需要解凍樣本以將已經冷凍的樣本分成幾個不同的分析/程序的較小等份，則樣本應該在冰上解凍，然後立即將較大的樣本重新分配到幾個較小的等份中，並立即重新冷凍直到分析，這樣可以最大程度地減少因額外處理而引入的任何變異性。必須注意的是，本研究未包括具有可見結晶、分離或變色的樣本，因此，可能會導致這些可觀察變化的樣本中脂質組成發生的變化未經測試。
另一方面，冷凍後基於密度的脂蛋白分離與HDL和LDL膽固醇濃度以及VLDL游離脂肪酸的顯著變化相關，以及LDL甘油三酯代謝物相對增加以及VLDL甘油三酯代謝物相對減少，這表明在冷凍解凍過程中可能發生了脂質的轉移和/或脂蛋白結構的物理變化。因此，對冷凍血清樣品進行基於密度的脂蛋白分離時應該要謹慎。
我們研究的一個潛在局限是，在實驗2中，只研究了來自一位捐贈者的血清樣本。我們不打算解答個人間或生物間的變異性問題，這是臨床研究界極感興趣的話題，並且此前已有研究（Ruhli et al. 2008; Zivkovic et al. 2008）。相反，為了解答冷凍解凍如何影響樣品穩定性的方法論問題，我們對血清樣品進行了三重分析。
結論
重要的臨床樣本通常需要在分析前進行儲存。通常情況下，還需要對已有樣本進行額外的分析，這些樣本代表了一種寶貴的資源。這些樣本可能來自特別容易受損的人群，或者可能代表了難以復制的獨特機會。在所有這些情況下，樣本的正確儲存和處理對於保留其信息性至關重要。本研究的結果表明，如果樣本得到妥善處理，那麼可以有效地消除由處理和貯存引入的潛在變異性，對於人體中具有生物學意義的大多數代謝物（例如高豐度代謝物）進行定量脂質組成分析，這是可能的。然而，在基於密度的分離之前冷凍確實會引入顯著的變異性，特別是在HDL和LDL膽固醇以及LDL和VLDL甘油三酯濃度方面。
參考文獻
-
Bachorik, P. S., Walker, R., Brownell, K. D., Stunkard, A. J., & Kwiterovich, P. O. (1980). Determination of high density lipoprotein-cholesterol in stored human plasma. Journal of Lipid Research, 21(5), 608–616.
-
Bachorik, P. S., Walker, R. E., & Kwiterovich, P. O., Jr. (1982). Determination of high density lipoprotein-cholesterol in human plasma stored at −70 degrees C. Journal of Lipid Research, 23(8), 1236–1242.
-
Bausserman, L. L., Saritelli, A. L., & Milosavljevic, D. (1994). High-density lipoprotein subfractions measured in stored serum. Clinical Chemistry, 40(9), 1713–1716.
-
Brousseau, T., Clavey, V., Bard, J. M., & Fruchart, J. C. (1993). Sequential ultracentrifugation micromethod for separation of serum lipoproteins and assays of lipids, apolipoproteins, and lipoprotein particles. Clinical Chemistry, 39(6), 960–964.
-
Cao, H., Gerhold, K., Mayers, J. R., Wiest, M. M., Watkins, S. M., & Hotamisligil, G. S. (2008). Identification of a lipokine, a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism. Cell, 134(6), 933–944.
-
Castile, J. D., & Taylor, K. M. (1999). Factors affecting the size distribution of liposomes produced by freeze-thaw extrusion. International Journal of Pharmaceutics, 188(1), 87–95.
-
Cevc, G., & Richardsen, H. (1999). Lipid vesicles and membrane fusion. Advanced Drug Delivery Reviews, 38(3), 207–232.
-
Comstock, G. W., Burke, A. E., Norkus, E. P., Gordon, G. B., Hoffman, S. C., & Helzlsouer, K. J. (2001). Effects of repeated freeze-thaw cycles on concentrations of cholesterol, micronutrients, and hormones in human plasma and serum. Clinical Chemistry, 47(1), 139–142.
-
Donnelly, J. G., Soldin, S. J., Nealon, D. A., & Hicks, J. M. (1995). Stability of twenty-five analytes in human serum at 22 degrees C, 4 degrees C, and −20 degrees C. Pediatric Pathology and Laboratory Medicine, 15(6), 869–874.
-
Ekbom, T., Lindholm, L. H., Lanke, J., & Nilsson-Ehle, P. (1996). Decrease in high density lipoprotein cholesterol during prolonged storage. CELL Study Group. Scandinavian Journal of Clinical and Laboratory Investigation, 56(2), 97–101.
-
Evans, K., Mitcheson, J., & Laker, M. F. (1995). Effect of storage at 4 degrees C and −20 degrees C on lipid, lipoprotein, and apolipoprotein concentrations. Clinical Chemistry, 41(3), 392–396.
-
Evans, K., Mitcheson, J., & Laker, M. F. (1997). Effect of storage at −70 degrees C on lipid, lipoprotein and apolipoprotein concentrations. Clinica Chimica Acta, 258(2), 219–229.
-
Folch, J., Lees, M., & Sloane-Stanley, G. H. (1957). A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissue. Journal of Biological Chemistry, 226, 497–509.
-
Kronenberg, F., Lobentanz, E. M., Konig, P., Utermann, G., & Dieplinger, H. (1994). Effect of sample storage on the measurement of lipoprotein[a], apolipoproteins B and A-IV, total and high density lipoprotein cholesterol and triglycerides. Journal of Lipid Research, 35(7), 1318–1328.
-
Kuchmak, M., Taylor, L., & Olansky, A. S. (1982). Suitability of frozen and lyophilized reference sera for cholesterol and triglyceride determinations. Clinica Chimica Acta, 120(2), 261–271.
-
Nanjee, M. N., & Miller, N. E. (1990). Evaluation of long-term frozen storage of plasma for measurement of high-density lipoprotein and its subfractions by precipitation. Clinical Chemistry, 36(5), 783–788.
-
Pini, C., Sommariva, D., Branchi, A., Scandiani, L., & Fasoli, A. (1990). Effects of serum storage on the determination of cholesterol. La Ricerca in clinica e in laboratorio, 20(1), 37–44.
-
Ruhli, F. J., Henneberg, M., Schaer, D. J., Imhof, A., Schleiffenbaum, B., & Woitek, U. (2008). Determinants of inter-individual cholesterol level variation in an unbiased young male sample. Swiss Medical Weekly, 138(19–20), 286–291.
-
Simo, J. M., Camps, J., Vilella, E., Gomez, F., Paul, A., & Joven, J. (2001). Instability of lipoprotein(a) in plasma stored at −70 degrees C: effects of concentration, apolipoprotein(a) genotype, and donor cardiovascular disease. Clinical Chemistry, 47(9), 1673–1678.
-
Stokes, Y. M., Salmond, C. E., Carpenter, L. M., & Welby, T. J. (1986). Stability of total cholesterol, high-density-lipoprotein cholesterol, and triglycerides in frozen sera. Clinical Chemistry, 32(6), 995–999.
-
Tiedink, H. G., & Katan, M. B. (1989). Variability in lipoprotein concentrations in serum after prolonged storage at −20 degrees C. Clinica Chimica Acta, 180(2), 147–155.
-
Watkins, S. M., Reifsnyder, P. R., Pan, H. J., German, J. B., & Leiter, E. H. (2002). Lipid metabolome-wide effects of the PPARgamma agonist rosiglitazone. Journal of Lipid Research, 43(11), 1809–1817.
-
Wood, P. D., Bachorik, P. S., Albers, J. J., Stewart, C. C., Winn, C., & Lippel, K. (1980). Effects of sample aging on total cholesterol values determined by the automated ferric chloride-sulfuric acid and Liebermann-Burchard procedures. Clinical Chemistry, 26(5), 592–597.
-
Zivkovic, A. M., Wiest, M. M., Nguyen, U., Nording, M. L., Watkins, S. M., & German, J. B. (2008). Assessing individual metabolic responsiveness to a lipid challenge using a targeted metabolomic approach. Metabolomics. doi:10.1007/s11306-008-0136-0.