揭示長期儲存和凍融對血脂數值影響的新發現

本翻譯僅作學術交流用,無商業意圖,請勿轉載,如有疑議問請來信

本研究發現,長達24個月的低溫儲存與多次凍融對血漿樣本中脂蛋白(a)、脂蛋白B和A-IV、總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇的測量值產生顯著變化。特別是在-80度C和-20度C儲存下,脂蛋白(a)在24個月後顯著下降。此研究強調了測量方法在血漿樣本長期儲存數據的再現性中的關鍵作用。

Effect of sample storage on the measurement of lipoprotein[a], apolipoproteins B and A-IV, total and high density lipoprotein cholesterol and triglycerides

樣本儲存對脂蛋白[a]、載脂蛋白B與A-IV、總膽固醇及高密度脂蛋白膽固醇和三酸甘油酯測量的影響

Kronenberg F, Lobentanz EM, König P, Utermann G, Dieplinger H. Effect of sample storage on the measurement of lipoprotein[a], apolipoproteins B and A-IV, total and high density lipoprotein cholesterol and triglycerides. J Lipid Res. 1994 Jul;35(7):1318-28. PMID: 7964193.

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/7964193/#:~:text=In%20contrast%2C%20apolipoproteins%20B%20and,%5Ba%5D%20and%20apolipoprotein%20B.

Abstract

This study investigated the influence of long-term storage, for periods up to 24 months, and multiple freezing and thawing on the measured values of lipoprotein[a] (Lp[a]), apo- lipoproteins B and A-IV, total and high density lipoprotein (HDL) cholesterol and triglycerides using plasma samples stored at -8OoC, -2O”C, and 4OC. Samples stored at -80°C or -20°C showed significant changes in Lp[a] after 24 months, with a mean decrease of 7% and 1376, respectively (P < 0.01). The major part of the decrease occurred during the first freezing and thawing. In contrast, apolipoproteins B and A-IV decreased continuously over time (P < 0.05). The increase in plasma con- centrations of total and HDL cholesterol and triglycerides was small but significant because of its uniformity. Multiple freezing and thawing influenced only the measured values of Lp[a] and apolipoprotein B.

Comparison of samples stored at -80°C and -2OOC showed no difference in any of the parameters at any time with the exception of Lp[a] after 18 and 24 months (P 0.05). After a storage period of 24 months, immunoblotting with detection of apo[a] was possible from samples under each storage condition. ApoB and apoA-IV were detectable only in samples stored at -2OOC or -8OOC. e These data, when compared to recent studies, suggest a critical role of the assay methodology in the reproducibility of measured Lp[a] and apo- lipoprotein plasma concentrations. We therefore recommend the examination of each system for measurement of long-term stored plasma samples.- Kronenberg, F., E-M. Lobentanz, P. Konig, G. Utermann, and H. Dieplinger. Effect of sample storage on the measurement of lipoprotein[a], apolipoproteins B and A-IV, total and high density lipoprotein cholesterol and triglycerides. J. Lipid Res. 1994. 35: 1318-1328.

摘要

本研究調查了長期儲存(最長達24個月)及多次冷凍和解凍對血漿樣本中測得的脂蛋白[a](Lp[a])、載脂蛋白B和A-IV、總膽固醇和高密度脂蛋白(HDL)膽固醇及三酸甘油酯的影響。樣本儲存在-80°C、-20°C 和4°C。儲存在-80°C 或-20°C的樣本在24個月後顯示出Lp[a]的顯著變化,平均分別減少了7% 和13%(P < 0.01)。主要的減少發生在第一次冷凍和解凍過程中。相比之下,載脂蛋白B和A-IV隨著時間的推移持續減少(P < 0.05)。由於總膽固醇和HDL膽固醇及三酸甘油酯的增加一致,雖然幅度較小但具有顯著性。多次冷凍和解凍僅影響Lp[a]和載脂蛋白B的測量值。儲存在-80°C和-20°C的樣本比較顯示除了18個月和24個月後的Lp[a]外,其他參數在任何時候都沒有差異(P < 0.05)。儲存24個月後,所有儲存條件下的樣本都可以通過免疫印跡檢測到apo[a]。載脂蛋白B和A-IV僅在儲存在-20°C 或-80°C 的樣本中可檢測到。這些數據與最近的研究相比,表明了測試方法在重現性上的關鍵作用。因此,我們建議檢查每個系統,以測量長期儲存的血漿樣本。- Kronenberg, F., E-M. Lobentanz, P. Konig, G. Utermann, 和 H. Dieplinger. 样本儲存對脂蛋白[a]、載脂蛋白B和A-IV、總膽固醇及高密度脂蛋白膽固醇和三酸甘油酯測量的影響。J. Lipid Res. 1994. 35: 1318-1328。

脂蛋白的常規臨床分析通常使用新鮮的血漿樣本。然而,對單個受試者進行多次採血的長期前瞻性或回顧性流行病學研究需要適當的血漿樣本儲存。這些樣本會個別冷凍和儲存,然後同時分析,以消除任何來自不同測試間變異的誤差來源。這需要在儲存期間各種脂蛋白和載脂蛋白的反應性具有一定的穩定性,以確保結果的可靠性。

從一個血漿樣本製作的等分試樣數量也很重要。等分試樣數量過少將需要反覆解凍和重新冷凍樣本進行分析。

因此,本研究的目的是調查在不同儲存溫度下最多儲存24個月(長期儲存研究)的脂蛋白[a]、載脂蛋白A-IV(apoA-IV)、載脂蛋白B(apoB)、總膽固醇、HDL膽固醇和三酸甘油酯的測量穩定性,以及重複冷凍-解凍循環和儲存管填充狀態的影響(冷凍和解凍研究)。

Lp[a]由一個類LDL顆粒和載脂蛋白[a](apo[a])組成,後者通過二硫鍵與apoB-100連接(1, 2)。幾項研究表明,Lp[a]是早發性冠心病和中風的獨立遺傳風險因素(參見參考文獻3)。載脂蛋白A-IV由腸道上皮細胞分泌,主要存在於血漿的無脂蛋白部分(4)。它可能在通過激活卵磷脂:膽固醇脂轉移酶(LCAT)(5)和促進脂肪組織細胞的膽固醇外排(6)中起重要作用。近年來,Lp[a]和逆向膽固醇轉運在動脈硬化研究中越來越重要。

圖1. 長期儲存研究設計示意圖。垂直箭頭標記了測量時間。詳情見文本。

載脂蛋白濃度已經通過多種免疫化學技術測量,包括放射免疫擴散法(RID)、電免疫測定法(EIA)、放射免疫測定法(RIA)、酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、熒光聯合免疫測定法(FIA)、免疫比濁法和濁度測定法。使用了多克隆和單克隆抗體。血漿脂質多年前就已經通過商業試劑盒進行測量。

關於長期儲存(7,8)和多次冷凍和解凍(9)對血漿中Lp[a]濃度的影響,僅有少量且相互矛盾的數據。Craig等人(7)顯示在6個月期間Lp[a]顯著下降46%。然而,赫爾辛基心臟研究(8)報告在8.5年的觀察期內沒有顯著變化。Sgoutas和Tuten(9)使用ELISA試劑盒證明,在-20°C進行一次冷凍-解凍循環後,Lp[a]測量值顯著降低。只有在-70°C進行三次冷凍-解凍循環後,這種下降才顯著(9)。

目前沒有關於樣本儲存對血漿中apoA-IV濃度影響的數據。對於apoB(10-13)、總膽固醇(14-16)、HDL膽固醇(17-25)和三酸甘油酯(14-16),則有相互矛盾的結果。

材料與方法

長期儲存

研究設計如圖1所示。從八名健康受試者中收集EDTA血液,經過過夜禁食後在冰上儲存20分鐘,直到離心。經過4°C下1,500 g低速離心15分鐘後,分離血漿並分成多個500 µl等分試樣,儲存在不同溫度(-80°C、-20°C和4°C)的微量離心管中(Ratiolab,德國Dreieich)。為獲得基線值,在血液收集後8小時內從新鮮血漿中測量Lp[a]、apoA-IV、apoB、總膽固醇、HDL膽固醇和三酸甘油酯。在4°C儲存的樣本分別在第3、5、9、15、22天,以及1、4、6、12、18和24個月後進行分析。在1、6、12、18和24個月後,將儲存在-20°C和-80°C的樣本在室溫下解凍並進行分析。樣本在稀釋前立即振盪,並在所有稀釋過程中保持在冰浴中。每個樣本稀釋並三次重複分析。為了最小化方法學的變異,所有來自-80°C、-20°C和4°C儲存條件的樣本都在同一微量滴定板上,由同一人在整個研究期間測量。此外,每個微量滴定板上三次重複測量兩個已知不同脂蛋白和載脂蛋白濃度的血漿樣本作為質量控制。

冷凍和解凍

圖2. 冷凍和解凍研究設計示意圖。詳情見文本。FT-cycle,冷凍-解凍循環。

研究設計如圖2所示。從六名健康受試者中收集EDTA血液,經過過夜禁食後在冰浴中儲存直到離心。經過4°C下1,500 g低速離心15分鐘後,分離血漿並分成500 µl的等分試樣,放入500 µl的微量管(Treff,瑞士Degersheim)以及3.6 ml的試管(Nunc CryoTubes,丹麥Roskilde)。每位受試者的一半500 µl管和一半3.6 ml管儲存在-20°C,另一半儲存在-80°C。500 µl管中的一個等分試樣儲存在冰浴中。

1小時後,將每個血漿樣本在不同儲存和管條件下的一個等分試樣在室溫下解凍,開蓋30秒後重新關閉,然後將血漿再次儲存在-20°C或-80°C。1小時後,同一等分試樣再次解凍和冷凍。這一過程在1小時後再次重複。同時,來自不同儲存和管條件的每個血漿樣本的額外等分試樣首次解凍。總結來說,我們除了新鮮血漿外,每個受試者有八個不同樣本(圖2):(A)500 µl管儲存在-80°C,一次冷凍和解凍循環;(B)500 µl管,-80°C,三次循環;(C)3.6 ml管,-80°C,一次循環;(D)3.6 ml管,-80°C,三次循環。(E)-(H)使用與(A)-(D)相同的管和冷凍-解凍循環,但儲存在-20°C。血液收集後5小時,所有冷凍-解凍循環完成,開始分析不同樣本。在分析過程中,所有樣本儲存在冰浴中。來自每位受試者的所有九種不同樣本條件都在同一微量滴定板上分析。所有樣本由同一人稀釋並三次重複測量。

實驗室程序

Lp[a] 的定量測定使用雙抗體ELISA,如文獻(26)所述。使用親和純化的多克隆apo[a]抗體作為包被抗體,並用辣根過氧化物酶標記的單克隆抗體1A2(Boehringer Mannheim,德國)作為檢測抗體。這種抗apo[a]抗體不與纖溶酶原交叉反應(27)。具體操作如下:微量滴定板(MaxiSorp F96,Nunc-Immuno Plate,丹麥Roskilde)用5 µg/ml的抗apo[a]包被,37°C孵育3小時,然後在4°C過夜保存。板子用洗滌緩衝液(PBS + 0.5 ml Tween 20/1)洗滌,並用0.1%的酪蛋白溶液在PBS中37°C封閉30分鐘。洗滌後,血漿樣本和標準品在37°C孵育2小時。血漿樣本用酪蛋白溶液稀釋,使其稀釋後的讀數在校準曲線的線性範圍內。對於在不同時間點的進一步分析,每個樣本按第0天第一次分析時的相同方式稀釋。一種商業化的Lp[a]陽性血漿(Immuno,奧地利維也納)以1:500-1:8,000的系列稀釋作為標準。所有稀釋均使用Hamilton稀釋器(Microlab 1000,瑞士Bonaduz)進行。進一步的洗滌步驟後,板子用標記的1A2抗體在37°C孵育2小時。最後一次洗滌後,在室溫和黑暗中用鄰苯二胺作為底物孵育25分鐘。反應用2 M硫酸終止。使用Bio-Rad的微量滴定板讀數器(Model 3550,美國加州Richmond)在490 nm波長下讀取吸光值,該值與Lp[a]濃度直接成正比。Lp[a]濃度以總Lp[a]脂蛋白質量表示。

載脂蛋白B的血漿濃度分析參考了之前的方法(28)。實驗室程序與Lp[a] ELISA相似。使用親和純化的兔多克隆抗apoB抗體作為包被抗體(4 µg/ml),並使用標記的同一抗體作為檢測抗體。所有血漿樣本用酪蛋白溶液以1:25,000的比例稀釋。一種經校準的標準品(Calibration Serum Apolipoprotein,Boehringer Mannheim,德國)以1:7,500-1:120,000的系列稀釋作為次級標準。

載脂蛋白A-IV的血漿濃度使用最近描述的ELISA測定(29)。簡而言之,使用親和純化的兔抗人apoA-IV多克隆抗血清(10 µg/ml)作為包被抗體,並用辣根過氧化物酶標記的抗體。已知apoA-IV含量的血漿作為校準標準。ELISA的操作如上所述。所有樣本以1:2,500的比例稀釋(包括在室溫下以1:50的4 M尿素稀釋液中預孵育1小時)。校準標準以1:500-1:8,000的系列稀釋。

總膽固醇、HDL膽固醇和三酸甘油酯使用Boehringer Mannheim的商業試劑盒測定。測量在微量滴定板上進行,方法如之前所述(30),有一些修改。對於膽固醇測量,4 µl樣本和四個校準標準(Preciset Cholesterol Calibrator,Boehringer Mannheim)由稀釋器與Monotest膽固醇試劑(CHOD-PAP方法)以1:50稀釋直接加到孔中,最終體積為200 µl。校準標準的最終濃度為8、4、2和1 mg/dl。對於HDL膽固醇測量,向100 µl血漿中加入250 µl HDL膽固醇沉澱試劑(磷鎢酸/MgCl₂)以沉澱含有apoB的脂蛋白。室溫下10分鐘後,用10,000 rpm離心10分鐘去除沉澱的脂蛋白。將50 µl澄清上清液與Monotest膽固醇試劑溶液以1:4稀釋,直接加到微量滴定板孔中,最終體積為200 µl。這個比例對所有樣本都是固定的。校準標準系列與總膽固醇相同。對於三酸甘油酯測量,8 µl血漿樣本與三酸甘油酯GPO-PAP試劑以1:25稀釋,方法與膽固醇相同。使用經重力法準備的甘油作為標準(30)。Boehringer Mannheim的Precinorm L作為測量總膽固醇、HDL膽固醇和三酸甘油酯的質量控制。室溫下孵育15分鐘後,立即在490 nm波長下用ELISA讀數器讀取吸光值。

在整個研究過程中,每種測試類型都使用相同批次的校準標準。

用於定量測定的測試的測內和測間變異係數(CV)見表1。測內CV是根據兩個不同樣本在20次重複測量中的均值和標準差計算的,公式如下:

測間CV是使用兩個不同樣本在2個月內16次測試中的數值按照相同公式計算的。變異係數在兩年的研究期間保持不變。

在研究結束時,使用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫印跡進一步檢測儲存在4°C、-20°C 和-80°C的樣本的穩定性。SDS-PAGE在還原條件下進行,如前所述(31)。apo[a]和apoB使用6.6%的聚丙烯酰胺凝膠,而apoA-IV使用15%的聚丙烯酰胺凝膠。免疫印跡使用的抗體與ELISA程序中使用的檢測抗體相同。

統計分析

表1. 測內和測間變異係數(CV)(%)

由於載脂蛋白A-IV和B、總膽固醇及HDL膽固醇的血漿濃度呈正態分布,使用配對t檢驗比較不同儲存條件下的數值。對於Lp[a]和三酸甘油酯,使用非參數配對Wilcoxon檢驗。時間變化的統計顯著性通過重複測量的方差分析計算。這種統計程序避免了僅在兩個時間點之間進行數據比較,通過使用所有數據來檢查隨時間變化的趨勢,因此可以平均消除每次測試間的變異影響。

在第一次分析中,從第零天到研究結束的每個時間點的所有數據都包括在方差分析中。為了排除第一次冷凍的影響,在第二次分析中,包括從第一個月結束到研究結束的所有數據。由於Lp[a]和三酸甘油酯的數據偏態分佈,這兩個參數在方差分析之前進行了自然對數轉換。

在長期儲存研究中,重複測量的方差分析在新鮮血漿樣本與儲存在-80°C和-20°C 1、6、12、18和24個月的樣本之間進行。第二步,同樣的分析針對1至24個月的數據進行。計算了新鮮血漿樣本與儲存24個月樣本在不同溫度下的相關係數(r),以及儲存24個月後不同儲存溫度之間的相關係數(r)。

變化百分比的計算公式如下:

在冷凍-解凍研究中,通過重複測量的方差分析評估冷凍-解凍循環變化的統計顯著性。

結果

長期儲存

、載脂蛋白及脂質的影響(平均值 ± 標準差)” style=”outline”]

表2顯示了在不同時間和儲存條件下各種載脂蛋白和脂蛋白的平均血漿濃度。表3描述了在4°C儲存最多6個月時相同的參數。圖3A-F展示了這些參數在不同時間的變化百分比。對於在4°C儲存的數據,僅繪製了前6個月的圖表。表4顯示了這些參數在新鮮血漿與儲存24個月的血漿之間的相關係數(r),以及儲存24個月後不同儲存溫度之間的相關係數。

儲存在-80°C和-20°C的樣本比較顯示,除了18個月和24個月後的Lp[a](P < 0.05)外,任何時間點的任何參數均無差異(表2)。然而,儲存24個月後,在-20°C或-80°C儲存的樣本之間所有測量參數的相關係數均高度顯著(表4)。

我們總是發現新鮮血漿樣本與儲存在-80°C或-20°C 24個月的樣本之間有高度顯著的相關性(表4)。三酸甘油酯和Lp[a]與新鮮血漿樣本的相關性最高。

儲存在-80°C或-20°C的Lp[a]在24個月後顯示出顯著變化,平均分別減少了7%和13%(表2和圖3A)。這些變化的主要部分發生在第一個月。儲存在4°C時,出現持續減少,15天後變化變得顯著,隨著時間的推移,測量值的恢復變得非常分散(表3和圖3A)。

儲存在-80°C 24個月的樣本顯示,apoB、apoA-IV、總膽固醇、HDL膽固醇和三酸甘油酯的平均變化分別為-5.4%(P < 0.05)、-9.1%(P < 0.05)、+2.2%(P < 0.01)、+3.7%(P < 0.01)和+6.8%(P < 0.05)。儲存在-20°C的樣本顯示非常相似的結果:-4.8%(P < 0.05)、-9.1%(P < 0.05)、+1.8%(不顯著)、+3.1%(不顯著)和+4.8%(P < 0.01)(圖3 B-F)。

圖4展示了每個儲存條件下24個月後一個樣本的apo[a]、apoB和apoA-IV的免疫印跡。所有三種儲存條件的樣本中均能檢測到apo[a]。apoB和apoA-IV僅在儲存在-20°C或-80°C的樣本中檢測到。

、載脂蛋白及脂質的影響(平均值 ± 標準差)”] 表4. 新鮮血漿與不同儲存溫度下儲存24個月樣本之間的相關係數 (r),以及不同儲存溫度下儲存24個月樣本之間的相關係數 (r)

冷凍和解凍

將儲存在無空氣間隙 (A、B、E、F) 或超過 3 ml 空氣間隙 (C、D、G、H) 的試管中的血漿多次冷凍和解凍,對於測量的 apoA-IV、總膽固醇、HDL 膽固醇或三酸甘油酯的數值沒有影響(表5及圖5)。儲存在 -80°C 3.6 ml 試管中的樣本,在一次和三次冷凍-解凍循環後,Lp[a] 的數值顯著低於新鮮血漿樣本。儲存在 -20°C 3.6 ml 試管和 -80°C 500 μl 試管中的樣本減少幅度接近顯著。ApoB 的回收率變異很大,因為這些不規則的變化,我們發現僅有 -80°C 3.6 ml 試管的數值有顯著變化。

、apoB 和 apoA-IV 的免疫印跡分析。apo[a] 型被確定為 S3,與同一供體新鮮樣本的多次表型分析結果一致。”]

討論

關於儲存條件對脂蛋白測定影響的爭議依然存在。我們的一個主要發現是,儲存於 -80°C 或 -20°C 長達 24 個月的樣本中,大多數脂質和載脂蛋白的測量穩定性沒有顯著差異(表2)。僅有 Lp[a] 值在 -20°C 儲存的樣本中顯著低於 -80°C 儲存的樣本,平均差異為 6%。這一顯著差異首次出現在儲存18個月後。Craig 等人(7)發現,在6個月內,兩種儲存溫度下的 Lp[a] 值沒有差異,這與我們的數據一致。但他們報告稱,用 RID 測量時,Lp[a] 在 6 個月內顯著持續下降 46%。我們發現,在 -80°C 儲存的樣本在6個月後平均下降 7%,在 -20°C 儲存的樣本平均下降 11%。24個月後,我們測得的下降值分別為 7% 和 13%。這些下降在兩個時間點上均顯著,但明顯低於 Craig 等人(7)的數據,他們的研究是在血清中進行的。目前尚不清楚凝血因子對 Lp[a] 穩定性的影響。在我們的研究中,大部分下降發生在第一個月(分別為 9% 和 10%),而不是在長期儲存期間(圖3)。從第一個月結束到第二年結束,我們發現 Lp[a] 血漿濃度沒有顯著變化。考慮到多次冷凍和解凍的結果(表5),我們認為測量值的下降是由第一次冷凍和解凍引起的。因此,長期儲存對 Lp[a] 的穩定性,或者更準確地說,對測量值的穩定性影響很小。

我們的 ELISA 系統由親和純化的多克隆抗 apo[a] 抗體用於包被和單克隆 1A2 用於檢測。顯然,這種單克隆 1A2 抗體針對的是 apo[a] 上的一個抗原表位,該表位在長期儲存期間相對保持完整。已證明該表位位於 apo[a] 的高度重複的 kringle IV 結構域上,包含線性序列 PEYYPN(H. Dieplinger 和 G. Utermann,未發表的結果)。儲存於 4°C 血漿中的 Lp[a] 測量在前 9 天非常穩定。之後,我們發現所有八個樣本的數值均低於新鮮樣本,且這些下降是顯著的。當分析平均值(表2和表3)和第一個月期間的變化百分比(圖3A)時,發現平均下降幅度低於冷凍樣本且變異較小。因此,在 4°C 儲存樣本 1 個月內測量 Lp[a] 的精確度與在 -20°C 或 -80°C 儲存樣本相同。儲存於 4°C 24 個月的樣本只要濃度高於 10 mg/dl,仍然可以進行 apo[a] 型別分析。在 -20°C 或 -80°C 儲存 24 個月的樣本也可以無問題地進行型別分析。重要的是,這些比較是在不同儲存條件下對相同樣本進行的。因此,除非 apo[a] 降解導致變化,否則不會改變同種型別。免疫印跡分析排除了降解,顯示同一供體的新鮮樣本經多次分析後呈現相同的模式。

多次冷凍和解凍對血漿樣本的 Lp[a] 測量值有影響(表5和圖5)。在所有儲存條件下,我們發現 Lp[a] 值降低,且在 -80°C 儲存的 3.6 ml 試管中的樣本顯著降低,在 -20°C 儲存的 3.6 ml 試管和 -80°C 儲存的 500 μl 試管中的樣本則接近顯著降低。這些發現與 Sgoutas 和 Tuten(9)相似,他們發現 -20°C 儲存的樣本在一次冷凍-解凍循環後顯著下降,而 -80°C 儲存的樣本在三次循環後顯著下降。他們使用了市售的 ELISA 系統。同一樣本用免疫比濁法(ITA)測量,在三次和四次循環後分別顯著下降。根據我們的 Lp[a] 測量數據,我們建議在正在進行的研究中,儲存條件不要改變,新鮮和冷凍血漿樣本不要比較。

、載脂蛋白及脂質在不同儲存溫度下的影響” style=”outline”]

圖5. 六個血漿樣本在多次冷凍-解凍及試管填充狀態下測量值的變化百分比,相較於新鮮血漿樣本的測量值。(A) -80°C 儲存的 500 μl 試管,一次冷凍和解凍循環;(B) -80°C 儲存的 500 μl 試管,三次循環;(C) -80°C 儲存的 3.6 ml 試管,一次循環;(D) -80°C 儲存的 3.6 ml 試管,三次循環;(E) 至 (H) 與 (A) 至 (D) 相同類型的試管和冷凍-解凍循環,但儲存於 -20°C。所有六個樣本的平均值以「+」圖示表示。

在頭幾個月內,我們觀察到儲存在 -80°C 和 -20°C 的樣本中測量的 apoB 略有增加,之後在24個月後均下降了 5%(P < 0.05,表2)。儲存在 4°C 的樣本中,我們也看到了同樣的模式,即第一個月內增加,之後下降(表3)。這些發現與 La Belle 等人(10)使用單克隆 ELISA 系統的結果一致。其他研究組發現 11 個月後沒有變化(11),或使用 ELISA 系統測量 18 個月後顯著下降 6.8%(12),以及使用放射免疫擴散法測量 22 個月後下降 6.5%(13),所有樣本均儲存在 -70°C。需要注意的是,我們研究中觀察到的變化小於 ELISA 的批間變異係數(CV),該係數接近 10%,因為需要兩個步驟才能達到 1:25,000 的最終稀釋倍數。這個高批間變異係數也解釋了測量值變化的廣泛分散。

測量的 apoA-IV 值顯示出隨時間的持續下降(P < 0.05,表2)。24 個月後,儲存在 -80°C 的樣本變化為 9%,儲存在 -20°C 的樣本變化為 7.5%。儲存在 4°C 的樣本在第一個月內非常穩定。從第六個月到研究結束,觀察到超過 90% 的急劇下降。24 個月後,儲存在 4°C 的樣本中免疫印跡分析未顯示可檢測的 apoA-IV 帶,這表明 apoA-IV 已解體和/或表位不再可檢測到我們的抗 apoA-IV 抗體。與 Lp[a] 不同,apoA-IV 的下降是持續的,而不是由第一次冷凍和解凍引起的。這一點在冷凍-解凍研究中得到了證實,我們觀察到多次冷凍和解凍後沒有顯著變化。

總膽固醇和 HDL 膽固醇在儲存在 -80°C 的樣本中觀察到增加(表3,圖3,D 和 E)。這些小的增加(分別為 +2.2% 和 +3.7%)因其一致性而在統計上顯著。然而,這些差異在批間變異範圍內,因此無意義。其他研究組在較短的儲存期間內未觀察到總膽固醇的差異(14, 15),或在 -20°C 儲存 2 週期間顯示增加近 15%(16)。尚未有超過 2 年的長期儲存數據發表。大量研究調查了 HDL 膽固醇的穩定性,結果存在爭議:增加(17, 18)、下降(19-22)和無變化(23)均有報導。Bachorik 等人(24, 25)報告稱儲存在 -20°C 和 -70°C 的樣本中 HDL 膽固醇下降,但這些變化與 HDL 膽固醇水平相關。

使用 Boehringer 試劑盒,Pini 等人(16)觀察到儲存在 -20°C 2 週後甘油三酯增加 10.4%。其他研究未確認此類變化(14, 15)。我們也發現儲存在 -80°C 的樣本增加了 6.8%,儲存在 -20°C 的樣本增加了 4.8%,這些增加雖小但顯著。

如圖 3,D-F 和圖 5 所示,總膽固醇、HDL 膽固醇和甘油三酯的變化非常小,且在長期儲存研究和冷凍-解凍研究中回收率接近 100%。這三個參數中,大空間試管中的蒸發影響很小(表5)。

在檢查所有這些數據時,我們必須考慮所用定量系統的批間變異係數(表1)。對於所有脂質和載脂蛋白,冷凍樣本與新鮮樣本之間的差異總是低於兩倍批間變異係數。只有儲存 24 個月的 -20°C 样本中的 Lp[a] 血漿濃度下降(-13%)大於兩倍批間變異係數。對於 Lp[a],我們必須記住,大部分下降發生在第一個月內,長期儲存對測量值影響很小。因此,我們建議在正在進行的研究中,樣本子組的儲存條件不要改變,且不要將冷凍儲存樣本與新鮮血漿樣本進行比較。

我們意識到從八個樣本中推廣我們結論的問題。由於所有八個受試者樣本中的趨勢非常一致,儘管樣本數量較少,我們仍然認為可以謹慎地推廣我們的結果。另一方面,當我們將結果與其他人的結果比較時,不同測定方法之間的差異很大(7)。

總之,我們發現儲存在 -80°C 和 -20°C 的樣本之間只有少數顯著差異,所有脂蛋白和載脂蛋白的長期觀察變化都比其他研究者小。由於測量 Lp[a] 和其他載脂蛋白與其他定量系統的結果不同,需要針對每種抗體和測定類型進行長期儲存和多次冷凍解凍對血漿樣本影響的研究。

本研究得到奧地利“科學研究基金”(S-4604 和 P-10080)Hans Dieplinger 和 Gerd Utermann 的資助。我們感謝奧地利格拉茨大學生理學研究所的 Karl P. Pfeiffer 博士對我們統計數據的批判性審查。

參考文獻

Utermann, G., and W. Weber. 1983. Protein composition of
Lp[a] lipoprotein from human plasma. FEBS Lett. 154:
2. Gaubatz, J. W., C. Heideman, A. M. Gotto, Jr., J. D.
Morrisett, and G. H. Dahlen. 1983. Human plasma lipo-
protein[a]: structural properties. J Biol. Chem. 258:
3. Utermann, G. 1989. The mysteries of lipoprotein[a].
Science. 246: 904-910.
4. Utermann, G., and U. Beisiegel. 1979. Apolipoprotein
A-IV a protein occurring in human mesenteric lymph
chylomicrons and free in plasma. Isolation and quantifica-
tion. Eur J. Biochm. 99: 333-343.
5. Steinmetz, A., and G. Utermann. 1985. Activation of leci-
thin:cholesterol acyltransferase by human apolipoprotein
A-1V.J. Biol. C h m . 260: 2258-2264.
6. Steinmetz, A., R. Barbaras, N. Ghalim, V. Clavey, J-C.
Fruchart, and G. Ailhaud. 1990. Human apolipoprotein
A-IV binds to apolipoprotein A-I/A-I1 receptor sites and
promotes cholesterol efflux from adipose cells. J. Biol. Chem.
7 . Craig, W. Y., S. E. Poulin, N. R. Forster, L. M. Neveux,
N. J. Wald, and T. B. Ledue. 1992. Effect of sample storage
on the assay of lipoprotein[a] by commercially available
radial immunodiffusion and enzyme-linked immunosor-
bent assay kits. Clin. Chem. 38: 550-553.
8. Jauhiainen, M., P. Koskinen, C. Ehnholm, M. H. Frick,
M. Manttari, V. Manninen, and J. K. Huttunen. 1991.
Lipoprotein[a] and coronary heart disease risk: a nested
case-control study of the Helsinki Heart Study participants.
357-361.
4582-4589.
265: 7859-7863.
Kronmberg et al. Influence of storage on lipoprotein parameters 1327
by guest, on June 12, 2013www.jlr.orgDownloaded from
Atherosclerosis. 09: 59-67.
Sgoutas, D. S., and T. Tuten. 1992. Effect of freezing and
thawing of serum on the immunoassay of lipoprotein[a].
Clin. Chem. 30: 1873-1877.
La Belle, M., K. S. Mok, A. E. Karu, and R. M. Krauss.
1990. Increased immunoreactivity of apolipoprotein B epi-
topes during prolonged storage of low density lipoproteins.
Clin. Chim. Acta. 191: 153-160.
Albers, J. J., M. S. Lodge, and L. K. Curtiss. 1989. Evalua-
tion of a monoclonal antibody-based enzyme-linked im-
munosorbent assay as a candidate reference method for the
measurement of apolipoprotein B-100. J. Lipid Res. 30:
1445-1458.
Brown, S. A,, D. E Epps, J. K. Dunn, A. R. Sharrett, J. R.
Patsch, A. M. Gotto, Jr., and W. Patsch. 1990. Effect of
blood collection and processing on radioimmunoassay
results for apolipoprotein B in plasma. Clin. Chem. 36:
Kafonek, S., P. S. Bachorik, and P. 0.J. Kwiterovich. 1989.
Measurement of apolipoprotein B in plasma from hyper-
lipidemic subjects treated with cholestyramine or placebo:
differential effects of storage at -7OOC. Clin. Chem. 35:
Tiedink, H. G., and M. B. Katan. 1989. Variability in lipo-
protein concentrations in serum after prolonged storage at
-20°C. Clin. Chim. Acta. 180: 147-155.
Stokes, Y. M., C. E. Salmond, L. M. Carpenter, and T. J.
Welby. 1986. Stability of total cholesterol, high-density-
lipoprotein cholesterol, and triglycerides in frozen sera.
Clin. Chem. 32: 995-999.
Pini, C., D. Sommariva, A. Branchi, L. Scandiani, and
A. Fasoli. 1990. Effects of serum storage on the determina-
tion of cholesterol. Res. Clin. Lab. 20: 37-44.
Curb, J. D., M. J. Overturf, and R. B. Harrist. 1980. Labil-
ity of HDL-cholesterol during serum storage. Atherosclerosis.
Reckless, J. P. D., D. J. Betteridge, P. Wu, B. Payne, and
D. J. Galton. 1977. Effect of storage on plasma-lipoproteins.
Lancet. ii: 350.
Demacker, P. N., and A. P. Jansen. 1983. Stability of high-
density-lipoprotein cholesterol in frozen sera. Clin. Chem.
Nanjee, M. N., and N. E. Miller. 1990. Evaluation of long-
term frozen storage of plasma for measurement of high-
density lipoprotein and its subfractions by precipitation.
Clin. Chem. 36: 783-788.
Patsch, W.,S. A. Brown, J. D. Morrisett, A. M. Gotto, Jr.,
1662-1666.
380-383.
37: 641-645.
29: 567-568.
and J. R. Patsch. 1989. A dual-precipitation method evalu-
ated for measurement of cholesterol in high-density lipo-
protein subfractions HDLZ and HDL3 in human plasma.
Clin. Chem. 35: 265-270.
Khan, S. R., and R. S. Elkeles. 1984. Effect of storage on
the precipitation procedure for the measurement of HDL
subclasses in serum. Clin. Chim Acta. 144: 59-63.
Miller, N. E., 0. H. Forde, D. S. Thelle, and 0. D. Mjos.
1977. The Tromsp heart study. High-density lipoprotein
and coronary heart-disease: a prospective case-control
study. Lancet. i: 965-967.
Bachorik, P. S., R. Walker, K. D. Brownell, A. J. Stunkard,
and P. 0. Kwiterovich. 1980. Determination of high density
lipoprotein-cholesterol in stored human plasma. J. Lipid
Res. 21: 608-616.
Bachorik, P. S., R. E. Walker, and P. 0. Kwiterovich, Jr.
1982. Determination of high density lipoprotein-cholesterol
in human plasma stored at – 7 O O C . J. Lipid Res. 23:
Menzel, H-J., H. Dieplinger, C. Lackner, F. Hoppichler,
J. K. Lloyd, D. R. Muller, C. Labeur, P. J. Talmud, and G.
Utermann. 1990. Abetalipoproteinemia with an apoB-100-
lipoprotein[a] glycoprotein complex in plasma. Indication
for an assembly defect. J Biol. Chem. 265: 981-986.
Kraft, H. G., H. Dieplinger, E. Hoye, and G. Utermann.
1988. Lp[a] phenotyping by immunoblotting with poly-
clonal and monoclonal antibodies. Arteriosclerosis. 8:
Dieplinger, H., C. Lackner, F. Kronenberg, C. Sandholzer,
K. Lhotta, F. Hoppichler, H. Graf, and P. Konig. 1993.
Elevated plasma concentrations of lipoprotein[a] in patients
with end-stage renal disease are not related to the size poly-
morphism of apolipoprotein[a]. J Clin. Invest. 91: 397-401.
Rosseneu, M.,G. Michiels, W. Dekeersgieter, J. B. Bury,
J. P. De Slypere, H. Dieplinger, and G. Utermann. 1988.
Human apolipoprotein A-IV quantitation by sandwich
enzyme-linked immunosorbent assay. Clzn. Chem. 34:
739-743.
Belcher, J. D., J. 0. Egan, G. Bridgman, R. Baker, and
J. M. Flack. 1991. A micro-enzymatic method to measure
cholesterol and triglyceride in lipoprotein subfractions
separated by density gradient ultracentrifugation from 200
microliters of plasma or serum. J. Lipid Res. 32: 359-370.
Utermann, G., H. J. Menzel, H. G. Kraft, H. C. Duba,
H . G. Kemmler, and C. Seitz. 1987. Lp[a] glycoprotein
phenotypes. Inheritance and relation to Lp[a]-lipoprotein
concentrations in plasma. J Clin. Invest. 80: 458-465.