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口腔唾液檢驗：新方法快速檢測牙周病

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03
5 月

本翻譯僅作學術交流用，無商業意圖，請勿轉載，如有疑議問請來信

瑞士蘇黎世大學的研究團隊開發了一種新的口腔診斷方法，利用唾液測試條快速檢測牙周病。 這種簡單且成本效益高的方法可以顯著提高診斷速度和準確性。 研究顯示，透過分析患者唾液中的乳鐵蛋白、鹼性磷酸酶等生物標記物，可以有效區分健康個體和牙周病患者，為牙周病的早期診斷和治療提供了新的可能性。

Ramenzoni LL, Lehner MP, Kaufmann ME, Wiedemeier D, Attin T, Schmidlin PR. Oral Diagnostic Methods for the Detection of Periodontal Disease. Diagnostics (Basel). 2021;11(3):571. Published 2021 Mar 22. doi:10.3390/diagnostics11030571

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33810094/

Abstract

Periodontitis is a common immune-inflammatory oral disease. Early detection plays an important role in its prevention and progression. Saliva is a reliable medium that mirrors periodontal health and is easily obtainable for identifying periodontal biomarkers in point-of-care diagnostics. The aim of this study is to evaluate the effectiveness of diagnostic salivary tests to determine periodontal status. Whole saliva (stimulated/unstimulated) from twenty healthy and twenty stage III grade B generalized periodontitis patients was tested for lactoferrin, alkaline phosphatase, calcium, density, osmolarity, pH, phosphate, buffer capacity, salivary flow rate and dynamic viscosity. A semi-quantitative urinary strip test was used to evaluate markers of inflammation in saliva (erythrocytes, leukocytes, urobilinogen, nitrite, glucose, bilirubin, and ketones), clinical periodontal parameters and pathogenic bacteria. Concentrations of lactoferrin, hemoglobin, and leukocytes were found to be significantly higher in the stimulated and unstimulated saliva in periodontitis patients compared to healthy patients, whereas alkaline phosphatase levels were higher in unstimulated saliva of periodontitis patients (p < 0.05). Periodontal biomarker analysis using test strips may be considered rapid and easy tool for distinguishing between periodontitis and healthy patients. The increase in lactoferrin, hemoglobin, and leucocytes—determined by strip tests—may provide a non-invasive method of periodontal diagnosis.
Keywords: saliva; point-of-care diagnostics; periodontitis; biomarkers; oral disease

摘要

牙周炎是一種常見的免疫炎症性口腔疾病。早期檢測在預防和進展中起著重要作用。唾液是一種可靠的介質，可以反映牙周健康狀況，並且易於獲得，用於點護診斷中識別牙周生物標誌物。本研究的目的是評估診斷性唾液測試確定牙周狀態的有效性。從二十名健康人和二十名III期B級普通牙周炎患者的全唾液（刺激/未刺激）中檢測乳鐵蛋白、鹼性磷酸酶、鈣、密度、滲透壓、pH值、磷酸鹽、緩衝能力、唾液流速和動態黏度。使用半定量尿液條測試來評估唾液中的炎症標誌物（紅細胞、白細胞、尿膽原、亞硝酸鹽、葡萄糖、膽紅素和酮體）、臨床牙周參數和致病細菌。在牙周炎患者的刺激和未刺激唾液中發現乳鐵蛋白、血紅蛋白和白細胞的濃度顯著高於健康患者，而鹼性磷酸酶水平在牙周炎患者的未刺激唾液中較高（p < 0.05）。使用試紙進行牙周生物標誌物分析可被視為區分牙周炎和健康患者的快速簡便工具。通過條測試確定的乳鐵蛋白、血紅蛋白和白細胞的增加，可能提供一種非侵入性牙周診斷方法。
關鍵詞：唾液；點護診斷；牙周炎；生物標誌物；口腔疾病

1 簡介

牙周炎被認為是口腔中最普遍的免疫性發炎性疾病之一。它源於特定的病原細菌-宿主相互作用，導致牙周組織破壞。牙周炎的進展通常以不規則的活躍增加和休眠緩解的階段為特徵。傳統的臨床牙周評估方法，如口袋探測深度（PPD）、探測時出血（BOP）、臨床附著水平（CAL）和放射性骨量評估，被廣泛使用並有記錄。然而，這些傳統的牙周分類參數未能提供有關當前疾病活動、嚴重程度和破壞程度、未來進展和治療反應的重要信息。更重要的是，患者的生物表型並未得到傳統臨床評估方法的恰當反映，宿主對牙周細菌的反應及隨後的發炎負擔，即生物表型的影響，可能在很大程度上決定牙周炎的進展。此外，早期診斷可能導致更成功的治療。為了重新設計牙周疾病框架，新的牙周分類包括多維分期和分級系統參數，允許部分評估未來的牙周風險。儘管新的分級風險因素，即吸煙和糖尿病，被納入以預測未來牙周破壞的可能性，但它們仍無法確定疾病發作的確切時間。因此，將更強大的生物標記添加到新的分類系統中將有助於識別牙周炎的活躍期、監測進展並避免因此導致牙周治療的不當管理。
為了在新的分類系統中更好地臨床識別牙周炎的生物進展或階段，仍需要開發新的診斷測試。牙周炎與調節特定免疫反應密切相關，其調節因子通常在牙齦溝液（GCF）和疾病進展期間的唾液中發現。基於口腔液體的即時診斷曾被記錄為潛在的座椅測試，用於確定牙周疾病。為了測量疾病活動，已經證明唾液和牙齦溝液樣本能夠反映牙周狀況，可能是可靠的生物標記檢測介質。唾液在即時診斷中具有許多優點，因為它易於獲得，可以非侵入性地收集，並且富含超過一千種不同的慢性發炎和組織破壞的診斷性生物標記分子。此外，許多在血液中發現的化合物也存在於唾液中。因此，唾液是監測口腔和全身健康的非常有用的工具。在這方面，已提出了幾種分子方法，例如用於使用先進的實驗室技術在唾液中檢測牙周生物標記分子的RNA/DNA的PCR或蛋白質的ELISAs。然而，經進一步研究，更簡單且更易應用的唾液技術可能提供診斷牙周炎所需的病理生理參數，並且避免了傳統上需要的血液樣本或組織切片。此外，還缺乏簡單且負擔得起的方法，用於識別既能診斷該疾病又能預測未來疾病活動風險的生物標記。
本研究的目的是評估一種簡單、成熟且具有成本效益的尿液分析測試，以指示和診斷牙周炎。對比健康患者，使用一種半定量條測試，該測試在口腔研究中尚未應用，試圖輕鬆識別並區分牙周炎患者的六種唾液生物標記。此外，分析了唾液組成的差異，無論是在刺激還是非刺激狀態下。我們假設，一種傳統用於尿液分析的條測試可能同樣適用於牙周疾病生物標記的診斷測試，並有助於確定牙周炎患者的牙周發炎嚴重程度（分期）和風險（分級）。

2 材料與方法

2.1. 參與者與研究設計

共有40名（男性24名，女性16名）患者被轉介至蘇黎世大學牙醫醫學中心保守和預防牙科診所接受治療，同意參加本研究。對牙周炎患者的臨床考慮是根據2018年的新分類制定的。參與者的一半來自於被歸類為新的牙周炎分類系統的患者，他們表現出了III期普遍性牙周炎（牙間附著水平≥5mm，放射性骨量損失延伸到根的中段及以後，因牙周炎損失4-5顆牙齒）、B級進展（5年內放射性骨量損失<2mm，每天吸煙不超過半包，生物膜與破壞相對應）。牙周炎患者還表現出PPD≥6mm，垂直骨量損失≥3mm，二級或三級根分裂涉及，中等齒脊缺陷。其餘20個人是牙周健康者（PPD≤3mm），沒有CAL或BOP（≤10%），也沒有牙齦炎症的跡象（紅腫、臨床腫脹、水腫或疼痛）。在參與前，所有患者都對研究的內容和目的進行了全面的說明。他們也被告知了樣本的不可逆轉的匿名化和銷毀，他們隨時有權退出研究以及根據Art. 30 HFV（瑞士人類研究法）的匿名化後果。該研究方案已獲得蘇黎世州倫理委員會的批准（BASEC-Nr. 2018-00221），符合赫爾辛基宣言。關於樣本量計算，因文獻中沒有先前的數據，因此採用了0.5%的患病率。信心區間設置為95%，接受10%的誤差。在這些變量下，需要40名參與者。通過減少誤差並增加準確性，樣本數根據通常的參數增加。
牙周炎患者的納入標準是35至60歲之間的男性或女性，吸煙者和非吸煙者，患有III期B級普遍性牙周疾病，並且在其他方面健康良好，沒有系統風險因素的級別修改（即沒有蛀牙，沒有糖尿病，沒有HIV陽性狀態）。健康患者的納入標準是上述年齡範圍，沒有PPD≥3mm，沒有CAL，BOP（≤10%），或牙齦炎症。兩個測試組的排除標準如下：懷孕或哺乳期，過去6個月內曾接受抗生素和/或抗炎藥物治療和/或過去2年內接受牙周炎治療。

2.2. 臨床評估

由一位經過校準的檢查員（M.E.K.）對所有研究參與者的所有臨床參數和醫學和牙科病史/牙周狀態進行評估。評估包括以下臨床參數：蛀牙，缺失和充填牙齒；傾斜或過度侵襲；移動性和敏感性；臨床附著損失（CAL），PPD和BOP。使用手動探針（Deppeler SA，瑞士Rolle）在每顆牙齒周圍的六個點上測量牙周袋。記錄化膿是否存在，牙齦後退是否存在，齲齒是否存在，以及牙菌斑是否存在。如果有的話，使用不超過2年的現有X射線。在牙周炎組中，牙間附著水平≥5mm並且放射性骨量損失延伸到根的中段，並且因牙周炎而失去的牙齒≤4顆被認為是III期牙周炎。根據臨床參數CAL和PPD計算牙周發炎表面積（PISA）作為總牙周組織的百分比。

2.3. 樣本收集

研究參與者被指示在收集唾液樣本前的1小時內避免進食、飲水或刷牙。首先，未刺激的唾液定期吐出到一次性收集管中（Polystyrol PS，30 mL，Semadeni Plastics Group，瑞士Ostermundigen）持續15分鐘。隨後，要求患者咀嚼一小片石蠟薄膜（Bemis Company Inc. Oshkosh, WI, USA）約5分鐘，直到收集到刺激的唾液。唾液樣本被稱量，並計算唾液流速（mL/min）以進行進一步分析。最後，進行了基於RNA的微生物學採樣與微生物學檢測（Pado Test，應用免疫學研究所IAI AG，瑞士Zuchwil）。每位患者的所有樣本都被混合在一起，並送往外部實驗室以確定細菌標記物Aggregatibacter actinomycetemcomitans（Aa）、Tannerella forsythia（Tf）、Porphyromonas gingivalis（Pg）、Treponema denticola（Td）、Prevotella intermedia（Pi）和Filifactor alocis（Fa）的存在（或不存在）。

2.4. 唾液分析

在進行研究前，刺激和未刺激的唾液樣本被在4°C下以6000 rpm離心10分鐘，上清液被存儲在新的2 mL管中（Eppendorf AG，瑞士Schönbuch）在−80°C中。唾液滲透壓（mOsm/L）使用微滲透計（Fiske Model 210 Micro-osmometer，K. Schneider & Co. AG，瑞士Zurich）進行測量。使用Gerber滲透壓標準300 mOsm/kg H2O進行校準，以獲得300 mOsm/L唾液的結果。此外，分析了唾液樣本的pH值（Metrohm，瑞士Herisau）。 pH計在測量之前使用pH 7.00和pH 4.00的兩種緩衝溶液（Thermo Fisher Scientific AG，瑞士Reinach）進行校準。此外，使用0.1 M/L HCl溶液（PanReac AppliChem，德國Darmstadt）進行滴定，確定了唾液的緩衝能力（mL/0.1 M HCl）。緩衝能力對應於將0.1 M/L HCl溶液消耗到pH 5.7的量。磷酸鹽測定（mmol/L）在750 nm處使用分光光度計（Portmann Instruments AG，瑞士Biel-Benken）進行。獲得的數據乘以100以確定每毫升唾液中的磷濃度。鈣（Ca（mmol/L））也使用分光光度計在422 nm處（Analytic Jena AG，德國Jena）測定。最後，使用微型粘度計（Lovis 2000 M/ME，Anton Paar GmbH，奧地利格拉茨）對樣本的動態粘度（mPa.s）和密度（g/cm3）進行調查。根據Anton Paar GmbH的規格，在20°C下進行測定。在唾液樣本上進行了一種Combur9-Test Cobas試紙條（Roche Diagnostics GmbH，德國曼海姆）以確定pH、白細胞、紅細胞、硝酸鹽水平、蛋白質、葡萄糖、酮體、尿胆原和胆紅素。根據製造商的說明進行程序。試紙條在室溫下用10μL未刺激的唾液和來自每位參與者的樣本的10μL刺激唾液濕潤。1分鐘後，進行可能的顏色變化的目視檢查，並使用個別測試的顏色參考作為比較的依據。對於製造商的顏色參考的最清晰可見的顏色變化進行了記錄。由試驗確定的半定量參數包括以下項目：（1）pH（5/6/7/8/9）；（2）白細胞（陰性/10-25/75/500白細胞/µL）；（3）硝酸鹽（陰性/陽性）；（4）蛋白質（陰性/30/100/500 mg/dL）；（5）葡萄糖（50/100/300/1000 mg/dL）；（6）酮體（陰性/10/50/150 mg/dL）；（7）尿胆原（正常/1/4/8/12 mg/dL）；（8）胆紅素（陰性/1+/2+/3+）；以及（9）血紅蛋白/溶血紅細胞（陰性/10/25/50/250Ery/µL）。

Figure 1. 唾液樣本上進行的試紙條（Combur9-Test Cobas試紙條）

以確定：pH、白細胞、紅細胞、硝酸鹽水平、蛋白質、葡萄糖、酮體、尿胆原和胆紅素。（A）空白試紙條；（B）每個水/測試區域10 µL水/測試區域；（C）唾液樣本10 µL/測試區域；（D）顏色參考。

2.5. 唾液中鹼性磷酸酶和乳鐵蛋白的分析

使用動力學顏色測試（ab83371，Abcam，鹼性磷酸酶檢測試劑盒，英國劍橋）和96孔板（Thermo-fisher Scientific/Life Technologies，美國馬薩諸塞州沃爾瑟姆）在450 nm處使用分光光度計 （Bucher Biotec AG，瑞士巴塞爾）檢測鹼性磷酸酶（mU/mL）。 乳鐵蛋白（μg/mL）採用ELISA（酵素連結免疫吸附法試劑盒，Abcam，英國劍橋）依照先前描述的方案進行分析。 在微孔板閱讀器（EZ Read 400微孔板閱讀器；Biochrom，英國坎伯恩）上記錄每個ELISA的450 nm吸光度，並從測試值中減去吸光度參考值（540或570 nm）。 為了確認每個生物標記的稀釋因子，從每個測試組中對三個標本進行了實驗。 所有實驗均以三次重複進行。

2.6. 統計分析

使用統計軟體R（維也納奧地利統計計算基金會）和Microsoft Excel for Mac（v16.37，20051002，微軟公司，美國華盛頓州雷德蒙德）對數據進行分析和繪圖。 對表1、表2和表3中的所有參數進行統計評估，使用威爾科克森秩和檢驗，異常為二元資料的硝酸鹽則使用費希爾精確檢定進行檢定。 統計顯著水準設定為α ≤ 0.05。

表1。患者特徵、臨床參數的描述統計以及出血探測（BOP）和牙周炎炎症表面積（PISA）的炎症值在健康和牙周病患者中的中位數（IQR）比較（統計學顯著水平設置為α ≤ 0.05）。
表2。健康和牙周病患者中由刺激和非刺激唾液獲得的特定唾液參數的中位數（IQR）。
表3。唾液參數（膽紅素、紅血球、葡萄糖、血紅蛋白、酮體、白血球、亞硝酸鹽、pH值、蛋白質和尿胆原）的中位數（+/- IQR）。

3 結果

3.1. 臨床評估與樣本收集

所有參與者的描述統計分析列於表1中。簡而言之，本研究共評估了40名參與者，年齡介於35至60歲之間；其中20名參與者患有III期B級全身性牙周病，另外20名則是牙周健康者。對於牙周患者而言，平均集體PPD為4.24毫米，範圍為5-12毫米。而健康患者的平均集體沟深為2.01毫米，範圍為2-3毫米。接下來，通過記錄BOP並計算牙周炎症表面積（PISA）來確定臨床炎症值。健康患者表現出有限的BOP，其平均臨床附著水平（CAL）為1.86毫米。計算了最高值和最低值範圍之間的差異，發現健康患者的BOP較低，其四分位數範圍（IQR）為9，而牙周炎患者的IQR為28。如預期，牙周炎患者表現出增加的BOP，其平均CAL為3.45毫米。健康患者的IQR PISA值為366，而牙周炎患者的IQR值為2112，因此幾乎高出六倍。與健康患者相比，牙周炎患者的BOP和PISA都顯著較高（p <0.001）。

3.2. 唾液分析

未刺激和刺激唾液的唾液參數列於表2中。在未刺激唾液樣本中，健康患者的體積顯著更高（p = 0.003），唾液流速更高（p = 0.002）。對於刺激唾液在健康和牙周炎患者之間的比較，體積和唾液流速的差異並不具有統計學意義。牙周炎患者未刺激唾液中的碱性磷酸酶水平顯著高於健康患者（p = 0.03）。對於刺激唾液，這些水平並無顯著性（p = 0.2）。滲透壓在未刺激（p <0.001）和刺激（p = 0.006）唾液中均顯著較高。

在未刺激和刺激唾液中，乳鐵蛋白是健康和牙周炎患者之間最明顯的參數（見表3）；牙周炎患者中乳鐵蛋白的水平是健康患者的兩到三倍（見圖2）。

圖2。健康人和牙周病第III期B級患者刺激和非刺激唾液樣本中乳鐵蛋白測量的比較。

對於其他唾液參數——緩衝容量、鈣、密度、動力黏度、pH值和磷酸鹽——在健康或牙周病第III期B級患者的刺激或非刺激唾液中沒有顯著差異。就微生物學測試而言，所有樣本中都未檢測到Aa細菌。相反，Tf、Pg、Td、Pi和Fa都以極小的量被檢測到，檢測極限為＜0.3%（見圖3）。

圖3。在健康和牙周病患者中測試的牙周細菌物種的已知致病標誌物的標誌負載量（％）。TML：總標誌負載量。

使用尿液試紙Combur 9-Test Cobas評估唾液炎症，以識別膽紅素、紅血球、葡萄糖、血紅蛋白、酮體、白血球、亞硝酸鹽、pH值、蛋白質和尿胆原（見表3）。在非刺激或刺激唾液中均未檢測到膽紅素、葡萄糖、酮體或尿胆原。血紅蛋白作為尿液中血液成分的檢測指標，在健康和牙周病第III期B級患者的刺激和非刺激唾液中均被檢測到。此外，與健康患者相比，牙周病患者的血紅蛋白在非刺激（p = 0.0007）和刺激唾液（p = 0.006）中均較高。在白血球測量中，牙周病患者的顯著增加在刺激（p = 0.002）和非刺激（p = 0.002）唾液中均被檢測到。亞硝酸鹽值在非刺激和刺激唾液中均呈陽性，健康和牙周病患者之間沒有顯著差異。pH參數僅在非刺激唾液中顯著增加，這也是健康和牙周病患者的情況（p = 0.01）。此外，刺激唾液的pH值略微更鹼性（pH = 8）比非刺激唾液（pH = 7）。所有研究參與者的蛋白質檢測結果均為陽性，但在健康和牙周病患者的刺激（p = 0.3）和非刺激（p = 0.9）唾液中均沒有顯著差異。

討論

新開發的即時牙周診斷測試使我們推測，相比傳統的臨床評估方法，可能存在更好的診斷牙周炎和評估其階段活性的方法。本研究的主要目的是確定是否可以使用商業化、快速和廉價的尿液試紙條來確定III期B級泛發性牙周炎患者的唾液炎症參數。據我們所知，迄今為止，尿液試劑條測試尚未用於測試牙周炎炎症指標的唾液。我們的研究結果表明，唾液是一個適合的介質，可以使用快速和成本效益的尿液試紙來識別炎症。在這項研究中，選擇了尿液半定量診斷測試進行測試，因為其結果在1分鐘內即可得到，並且具有用於評估結果的用戶友好的顏色標度。與即時診斷測試相比，傳統的參數，如BOP和PPD，被建議作為舊牙周分類中主要的臨床測量，以確定正在進行中的牙周疾病。然而，僅僅BOP和PPD無法預測未來的牙周破壞。盡管新的分類系統將BOP的10%作為定義牙周健康的截止點，但由於可能存在患者的分期和分級之間的重疊，這可能會增加偽陽性診斷的風險。在各種即時測試中，尿液試劑條已被證明多年來在醫療機構中非常有效，而且在室溫下使用方便且成本低廉。事實上，半定量快速試紙測試最初是設計用於通過檢測酶白血球酯酶來識別尿液中與感染相關的多形核白血球和其他異常。除了用於尿路感染篩查外，白血球酯酶試驗已被評估用於許多細菌性炎症性疾病，包括腦膜炎、腹膜炎、腹部創傷的腹腔灌洗、幽門螺旋菌感染、炎症性關節滑液和陰道炎，並取得了可變的結果和可靠性。此外，尿液條試驗是為九種不同參數的分析而開發的，但並非所有這些參數都存在於唾液中。因此，在本研究中，膽紅素、葡萄糖、酮體和尿胆原參數在唾液中均無法檢測到，並在本研究中被發現為陰性。然而，測試的有意義結果顯示，與健康患者相比，牙周病患者（第III期B級）在刺激和非刺激唾液中的血紅蛋白和白血球水平顯著增加。對於白血球數量增加的一種解釋是，多形核白血球已知在牙齦炎症中起著關鍵作用，這些細胞的數量可能增加以維持口腔健康。以前的研究還表明，白血球生成的蛋白質LFA-1（淋巴細胞功能相關抗原-1）和ICAM-1（細胞間黏附分子-1）的水平與第III期C級泛發性牙周炎存在正相關。這一相關性在我們的結果中得到了確認，並且支持了白血球評估作為確定牙周疾病更進一步的發病機制和進展的可靠參數。近年來，已提議將多形核白血球的定量作為牙齦炎、牙周炎甚至全身炎症的篩查工具。至於高水平的血紅蛋白存在，一種解釋是，在唾液中，它可能源於牙周組織的出血。在這方面，本研究中的唾液血紅蛋白水平與先前的研究相符。正如本研究所示，血紅蛋白及其鐵含量也可能是評估牙周疾病進展階段的良好指標，因為在未治療的泛發性牙周炎（III-IV期B-C）中已經確定了鐵水平的增加。此外，血紅蛋白唾液檢測試驗可內置於牙科檢查中，可以大大幫助早期牙周炎的診斷並有助於維持口腔健康。

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